Sau khi thực hiện các phản ứng sinh hóa đặc biệt, so sánh kết quả ghi nhận đƣợc với bảng 5 để định danh các chủng vi khuẩn Vibrio spp.
Bảng 5: Đặc tính sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio spp.
(http://www.iso.org)
Kiểm tra Vibrio cholera Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus Vibrio vulnificus Vibrio fluvialis Oxidase + + + + + TSI Sinh hơi - - - - - Lactose - - - + - Sucrose + - - - + ODC + + + + - LDC + + + + - ADH - - - - + ONPG Hydrolysis + + - + + Indole + + + + +/- ASPW 0% NaCl + + - - - 2% NaCl + + + + + 6% NaCl - - + + + 8% NaCl - - + - - 10% NaCl - - - - - (ISO/TS 21872-2: 2007) 3.2.5 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Chuẩn bị canh khuẩn
Canh khuẩn đƣợc chuẩn bị sao cho chứa vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml (độ đục tƣơng đƣơng với ống Mc Farland 0.5).
Phƣơng pháp tiến hành
Dùng tăm bông vô trùng tẩm canh khuẩn đã chuẩn bị sau đó trải đều lên khắp mặt thạch MHA. Đặt các đĩa kháng sinh sao cho hai đĩa cách nhau 2,5cm-3,5cm và cách mép hộp thạch 2cm-2,5cm, phải đảm bảo các đĩa kháng sinh tiếp xúc thẳng với mặt thạch. Đem ủ ở 370C trong 24 giờ.
Cách đọc kết quả kháng sinh đồ
Việc đọc kết quả kháng sinh đồ đƣợc thực hiện bằng cách đo đƣờng kính vòng vô khuẩn sau đó so sánh với bảng tiêu chuẩn đƣờng kính vòng vô khuẩn của kháng sinh.
Nếu xung quanh đĩa kháng sinh không có vòng vô khuẩn (thạch đục đến tận mép đĩa kháng sinh). Ta kết luận vi khuẩn đã kháng với loại kháng sinh đó.
Nếu xung quanh đĩa kháng sinh có vòng trong suốt, đó là vòng vô khuẩn, nơi mà dƣới tác động của kháng sinh vi khuẩn không mọc đƣợc. Trong trƣờng hợp này ta tiến hành đo đƣờng kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm). So sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn với đƣờng kính vòng vô khuẩn chuẩn, lúc này ta có thể kết luận vi khuẩn nhạy cảm, đối kháng hay nghi ngờ (trung gian) đối với tác dụng của kháng sinh
Bảng 6: Bảng tiêu chuẩn đƣờng kính vòng vô khuẩn của kháng sinh
(http://clsi.org)
Tên kháng sinh Kí hiệu Hàm lƣợng (µg)
Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Nhạy Trung gian Kháng
Norfloxacin Nr 10 17 13-16 12 Tetracyline Te 30 15 12-14 11 Amoxiciline Ax 10 17 14-16 13 Trimethoprim/ Sulfamethoxazole Bt 1,25/23,75 16 11-15 10 Kanamycin Kn 30 18 14-17 13 3.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu trong nghiên cứu đƣợc xử lý thống kê theo phƣơng pháp chi bình phƣơng (χ2) và chƣơng trình Minitab 16.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả nuôi cấy phân lập vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu
Kết quả phân lập vi khuẩn Vibrio spp. trên 81 mẫu ốc bƣơu đƣợc thể hiện qua bảng 7.
Bảng 7: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu
Mẫu Số mẫu phân lập
(mẫu) Số mẫu dƣơng tính (mẫu) Tỷ lệ (%) Ốc bƣơu 81 23 28,4
Kết quả từ bảng 7 cho thấy số mẫu Vibrio spp. dƣơng tính là 23 trong tổng số 81 mẫu ốc bƣơu (28,4%). Tỷ lệ nhiễm này khá cao, điều này có thể là do vi khuẩn Vibrio spp. thƣờng sống ở các vùng ôn đới và nhiệt đới mà nƣớc ta lại có khí hậu nóng ẩm nên sẽ rất thuận lợi cho vi khuẩn Vibrio spp. phát triển (Oliver and Kaper, 1997).
Tuy nhiên, tỷ lệ này lại thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và ctv (2011), trên hải sản tƣơi sống ở Nha Trang có đến 60% chủng mang đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio spp. Điều này cũng khá hợp lý, bởi vì tuy ốc cũng đƣợc xếp vào dạng thủy, hải sản nhƣng ốc bƣơu lại là một loại ốc nƣớc ngọt mà loài vi khuẩn Vibrio spp. lại là loài ƣa muối, cần muối để phát triển (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2009).
4.2 Khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu theo địa điểm lấy mẫu lấy mẫu
Bảng 8: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu theo địa điểm lấy mẫu
Các giá trị trong cùng một cột có số mũ a giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa thống kê Chợ Số mẫu nuôi cấy
(mẫu) Số mẫu dƣơng tính (mẫu) Tỷ lệ (%) A B C D E F G 12 12 9 12 12 12 12 3 4 2 5 4 3 2 25a 33,33a 22,22a 41,67a 33,33a 25a 16,67a
Kết quả ở bảng 8 cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu ở chợ D là cao nhất chiếm 41,67%, thấp nhất là chợ G chiếm 16,67%. Tuy nhiên, sau khi xử lý thống kê thì các số liệu thống kê khác nhau không có ý nghĩa. Sự khác nhau giữa tỷ lệ nhiễm ở một số chợ trên có thể là do nguồn cung đƣợc lấy từ những chỗ khác nhau. Bên cạnh đó, còn do vào cách làm sạch, cách bảo quản của mỗi sạp không giống nhau, điều đó cũng góp phần làm ảnh hƣởng đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu giữa các chợ.
4.3 Kết quả định danh một số loài vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu bằng phản ứng sinh hóa phản ứng sinh hóa
Bảng 9: Kết quả định danh vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu bằng phản ứng sinh hóa
Từ kết quả ở bảng 9 cho thấy, chỉ có duy nhất 1 loài Vibrio spp. đƣợc tìm thấy trong mẫu ốc bƣơu là V. cholerae. Điều này cũng phù hợp với đặc tính có thể sinh trƣởng ở vùng nƣớc ngọt của loài V. cholerae. Ngoài ra, V. cholerae
là loài gây bệnh dịch tả cho ngƣời, nên cũng có thể do bị ảnh hƣởng bởi nguồn nƣớc của những ngƣời mang vi khuẩn này thải theo phân ra ngoài môi trƣờng làm lây nhiễm sang nguồn nƣớc mà ốc bƣơu sinh sống hay do có sự tiếp xúc giữa ngƣời bắt, ngƣời mua và ngƣời bán cũng có thể làm lây nhiễm. Vì vậy, việc tiêu thụ ốc bƣơu chƣa đƣợc nấu chín kỹ sẽ làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh dịch tả rất cao, song song đó là các vấn đề về ngộ độc thƣờng xảy ra.
Loài Vibrio spp. (n = 23) Số lƣợng mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%)
V. cholera 23 100
4.4 Kết quả kiểm tra tính nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn
Vibrio spp.
Bảng 10: Kết quả kiểm tra tính nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn
Vibrio spp. phân lập đƣợc Tên kháng sinh Kí hiệu Tổng số mẫu (mẫu)
Nhạy Trung gian Kháng Số lƣợng (mẫu) Tỷ lệ (%) Số lƣợng (mẫu) Tỷ lệ (%) Số lƣợng (mẫu) Tỷ lệ (%) Norfloxacin Nr 23 23 100 0 0 0 0 Tetracycline Te 23 23 100 0 0 0 0 Amoxicilin Ax 23 15 65,22 8 34,78 0 0 Kanamycin Kn 23 12 52,17 9 39,13 2 8,7 Trimethoprime/ Sulfamethoxazole Bt 23 22 96,65 1 4,35 0 0
Qua bảng 10 cho thấy rằng vi khuẩn V. cholera nhạy cảm cao với kháng sinh Norfloxacin (100%), Tetracyline (100%) và Trimethoprime/ Sulfamethoxazole (96,65%). Vi khuẩn này nhạy cảm trung bình với Amoxicillin (65,22%) cũng nhƣ với Kanamycin (52,17%).
Norfloxacin, Trimethoprime/ Sulfamethoxazole và Tetracycline có độ nhạy cao với vi khuẩn V. cholerae vì đây là nhóm kháng sinh có tính sát khuẩn và có phổ kháng khuẩn rộng. Theo Huỳnh Kim Diệu (2010), Norfloxacin thuộc nhóm Quinolones thế hệ II, những kháng sinh đƣợc tổng hợp hoàn toàn bằng phƣơng pháp hóa học cũng có tính sát khuẩn cao, phụ thuộc nồng độ nhƣng có thể gây ra hiện tƣợng chọn lọc các chủng vi khuẩn đề kháng.
Theo những nghiên cứu về vấn đề kháng của kháng sinh ở vi khuẩn
Vibrio spp. mà đặc biệt là vi khuẩn V. cholera đã đƣợc rất nhiều tác giả nghiên cứu trƣớc đây, kết quả cho thấy vi khuẩn này rất đa dạng về sự nhạy cảm đối với các loại kháng sinh, tùy thuộc vào thời gian và địa điểm nghiên cứu mà kết quả hầu nhƣ không giống nhau. Gần đây nhất, vi khuẩn V. cholera O1 ở Indonesia đề kháng với Erythoromycin, nhƣng lại nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh nhƣ Ampicilin, Ciprofloxacin, Tetracycline, Kanamycin, Norfloxacin, Trimethorprime/Sulfamethoxazole. Trong khi vi khuẩn V. cholera phân lập đƣợc ở Bangladesh vào khoảng thời gian 2002-2008 thì lại đề kháng với Tetracycline, Ciprofloxacin, Trimethorprime/Sulfamethoxazole, Erythoromycin và Furazolindone (Kim và ctv, 2010).
Kết quả nghiên cứu trên cũng khá phù hợp với với kết quả thử nghiệm của Nguyễn Thị Xuân Trang (2012): vi khuẩn V. cholerae nhạy cảm hoàn toàn
với Norfloxacin và Doxycyline (100%), khá nhạy cảm với Gentamycin (88,9%).
So sánh kết quả thử nghiệm của Li (2003) thì có hơn 50% các loài vi khuẩn Vibrio spp. nhạy cảm với Cotrimoxazole, Streptomycin, Trimethoprime và Penicillin. 100% các loài Vibrio spp. nhạy cảm với Norfloxacin và Meropenem.
Hình 9: Sự nhạy cảm của vi khuẩn
V.cholerae với một số loại kháng sinh
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Sau khi tiến hành thí nghiệm phân lập vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu thu đƣợc kết quả nhƣ sau: có 23 mẫu dƣơng tính trong tổng số 81 mẫu, tỷ lệ nhiễm này khá cao (28,4%). Bằng những phản ứng sinh hóa đặc biệt đã xác định đƣợc tất cả các mẫu dƣơng tính với vi khuẩn Vibrio spp. đều là V. cholera. Vi khuẩn V. cholera rất nhạy cảm với Norfloxacin, Tetracycline, Trimethoprime/Sulfamethoxazole và nhạy cảm ở mức độ trung bình đối với Amoxcixilin và Kanamycin.
5.2 Đề nghị
Để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe cho mọi ngƣời, chúng tôi có một số ý kiến nhƣ sau:
Giáo dục, tuyên truyền cộng đồng về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm.
Không nên ăn ốc bƣơu khi chƣa chế biến kỹ.
Cần nghiên cứu thêm sự lƣu hành của vi khuẩn Vibrio spp. trên ốc bƣơu theo mùa tại Việt Nam.
Tiến hành kiểm tra thêm nhiều thủy, hải sản nƣớc mặn, nƣớc ngọt khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế-Viện dinh dƣỡng, 2000. Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam. NXB Y học Hà Nội.
2. Bùi Mạnh Hà (2006) “Ngộ độc thực phẩm và cách phòng tránh”, Tạp chí báo thanh niên 06/02/2006.
3. Bùi Quang Tề (2006), Bệnh học thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản. 4. Đặng Đức Trạch, Đỗ Gia Cảnh, Phạm Kim Sắc, Đỗ Thung, Nguyễn Đức Khiển (1993), “Bệnh dịch tả tại Việt Nam trong những năm gần đây”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, số 3, trang 50.
5. Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB giáo dục Việt Nam.
6. Đoàn Thị Nguyện và Nguyễn Văn Dịp, 2008. Vi sinh vật y học. Nhà xuất bản Y học.
7. Lê Thị Oanh (2012), Vi sinh y học, NXB giáo dục Việt Nam.
8. Lƣơng Văn Đàm, Nguyễn Bá Cẩn, Hoàng Văn Sinh, Vũ Văn Nhung, 2003. “Một số nhận xét về các vụ dịch tả tại Thanh Hoá”. Công trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Thanh Hoá, tr.58-65.
9. Nguyễn Anh Dũng, 1991. “Bệnh tả và công tác chuẩn bị phòng chống dịch”. Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(1), tr.3-7.
10. Nguyễn Bình Minh, Ngô Tuấn Cƣờng, Lê Thanh Hƣơng, Nguyễn Hoài Thu (2008), “Đánh giá kít chuẩn đoán nhanh Vibrio cholerae O1 gây bệnh tả”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(2), trang 51-56.
11. Nguyễn Công Tỷ và Nguyễn Duy Phong (2006), Những bệnh miền nhiệt đới thường gặp, NXB y học Hà Nội.
12. Nguyễn Đăng Hiền, Nguyễn Thị Mai Hƣơng, Đặng Ngân Hà, 2008. “Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tiêu chảy do virut Rota tại Việt Nam từ 2007- 2008”. Tạp chí Y học dự phòng, 5(7), tr.19-20.
13. Nguyễn Đình Bảng, 1992. Vi khuẩn tả. Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr.169-170.
14. Nguyễn Đồng Tú, Ngô Tuấn Cƣờng, Nguyễn Hoài Thu, Lê Thanh Hƣơng, Nguyễn Bình Minh, Đỗ Kim Ninh, Phạm Văn Dịu, Trần Minh Thuỷ, 2008. “Giám sát Vibrio cholerae O1 và Vibriophage trong môi trường nước ngoại cảnh - Các yếu tố dự báo dịch tả”. Tạp chí Y học dự phòng, 18(4), tr.13-18.
15. Nguyễn Gia Khánh, 2008. “Trẻ em Việt Nam mắc bệnh tiêu chảy cấp đứng thứ 3 Châu Á”. Mục Y Tế sức khỏe (sggp.org.Vn/y te suc khoe/2008/10) .
16. Nguyễn Khánh Linh (2010), “Vi khuẩn Vibrio cholerae và bệnh dịch tả ”,Tạp chí Khoa học và ứng dụng, số 3.
17. Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. NXB Nông nghiệp, tr. 68-142.
18. Nguyễn Phú Quý (1993), “Chẩn đoán vi khuẩn học bệnh tả do V. cholerae O139”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 3(3), trang 52.
19. Nguyễn Phú Quý, Phùng Đắc Cam, Lƣơng Ngọc Trâm (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, NXB Văn hoá, Hà Nội, trang 78-81.
20. Nguyễn Tăng Ấm, Đặng Đức Trạch, Nguyễn Duy Thanh, 1983. Bệnh tả ElTor, dịch tễ học và lâm sàng. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.7-195.
21. Nguyễn Thị Hiền (chủ biên), 2009. Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương thực-thực phẩm. Đại học bách khoa Hà Nội, tr. 50-58.
22. Nguyễn Trần Chính (1997), Giáo trình bệnh truyền nhiễm, Bộ môn truyền nhiễm – Trƣờng Đại Học Y Dƣợc Thành Phố Hồ Chí Minh.
23. Nguyễn Trần Chính và ctv (2008), Bệnh học truyền nhiễm và nhiệt đới, Bộ môn truyền nhiễm – Trƣờng Đại Học Y Dƣợc Thành Phố Hồ Chí Minh.
24. Nguyễn Trần Hiển, Phạm Ngọc Đính, 2007. “Tài liệu qui trình xét nghiệm, điều tra, giám sát, phòng chống bệnh tả”. Bộ Y tế, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng, Hà Nội, tr.1-28.
25. Phạm Hồng Sơn, 2005. Giáo trình vi sinh vật học thú y. Đại học Huế, tr. 30-32. 26. Phạm Thế Vũ, 2009. Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008. Luận văn thạc sỹ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên, Việt Nam. 27. Phùng Đắc Cam, 2003. Vibrio cholerae và bệnh dịch tả. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.53-74.
28. Trần Linh Thƣớc, 2009. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục, tr. 131-136.
29. Trần Văn Hƣng, 2008. Giáo trình Vi sinh học y học. Đại học Huế, tr.122-125. 30. Vũ Minh Hƣơng, Nguyễn Đình Muôn, Nguyễn Văn Hiếu, 1994. “Một số trƣờng hợp mắc tả tại Hải Phòng năm 1994”. Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(2), tr.60-75. Tài liệu tiếng Anh
1. Brenner, D.J.; Hickman-brenner, F.W.; Lee, J.V.; Steigerwalt, A.G.; Richard, F.G.; Hollis, D.G.; Farmer III, J.J.; Weaver, R.E.; Joseph, S.W.; Seidler R.J., 1983.
Vibrio furnissii (Formerly Aerogenic Biogroup of Vibrio fluvialis), a new species isolated from human feces and the environment. J. Clin. Microbiol. 18, 816-824. 2. Briko I.I., Bachtarzi T., Ourtani A., Laouar M, 1985. “Cholerae morbidity problems in 1 of the departments of the Democratic and Popular Republic of Angeria”. Microbiol Epidemiol Immunobiol, 37(5), pp.45-51.
3. CLSI, 2011. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 4. Craig J. P., Yamamoto K., Takeda Y. and Miwatani T., 1981. Production of cholera-like enterotoxin by a Vibrio cholerae non-O1 strain solated from the environment. Infection and Immunity 34 (1): 90 – 97.
5. Davis, B. R., Fanning, G. R., Madden, J. M., Steigerwalt, A. G., Bradford, H. B., Jr., Smith, H.L., Jr and Brenner, D.J., 1981. Characterization of biochemically atypical Vibrio cholerae strains and designation of a new pathogenic species, Vibrio mimicus. J. Clin. Microbiol., 14, 631-639.
6. Farmer III J. J. and Hickman-Brenner F. W., 2006. The Genera Vibrio and
Photobacterium. In The Procaryotes 3rd edition volume 6 (Eds: D. Martin, F. Stanley, R. Eugene, S. Karl-Heinz and S. Erko). Springer, Singapore, pp. 508 – 543. 7. Fujino T, Okuno Y, Nakada D, Aoyama A, Fukai K, Mukai T, Ueho T, 1951. On the bacteriological examination of Shirasu food poisoning. J. Japan. Ass. Infect. Dis., 35: 11-12.
8. Hlady, W.G., 1997. Vibrio infections associated with raw oyster consumption in Florida, 1981–1994. Journal of Food Protection, 60: 353–357.
9. Honda, T., Ni, Y.X. & Miwatani, T., 1988. Purification and characterization of a hemolysin produced by a clinical isolate of Kanagawa phenomenon-negative Vibrio parahaemolyticus and related to the thermostable direct hemolysin. Infection and Immunity, 56(4): 961–965.
10. ISO/TS 21872-2, 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. – Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae.
11. Kaper J. B., Morris J. G. and Levine M. M., 1995. Cholerae. Clin. Microbiol. Rev., 8 (1): 48 – 86.
12. Kassis S., Hagmann J. and Fishman P. H., 1982. Mechanism of action of cholera toxin on intact cells: generation of A1 peptide and activation of adenylate cyclase. J. Biol. Chemist.,257 (20): 12148 – 12152.
13. Kelly MT, Hickman-Brenner FW, Farmer III J-J, 1991. Vibrio In: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg DHD, Shadomy HJ, ed. Manual of clinical