Phƣơng pháp xử lý mẫu
Mẫu sau khi lấy về phòng thí nghiệm ta tiến hành nhƣ sau: Tiến hành sát trùng mẫu bằng cách dùng bông gòn có tẩm cồn lau sạch vỏ để tránh lây nhiễm vi sinh vật từ ngoài vỏ. Sau đó dùng kẹp đƣợc sát trùng tiến hành tách mài ốc ra. Khi mài đƣợc tách ra dùng tăm bông vô trùng quét chất dịch bên trong, ngoáy tăm bông trực tiếp vào phần thịt ốc sau đó cho tăm bông và cả phần chất lỏng vào môi trƣờng Alkaline Saline Peptone Water (ASPW) đã chuẩn bị sẵn.
Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Vibrio spp.
Tăng sinh vi khuẩn bằng cách cho vào môi trƣờng peptone kiềm 2% NaCl. Sau đó, đem ủ vào tủ ấm 370C khoảng 18-24 giờ. Dùng que cấy vòng lấy nƣớc trong môi trƣờng ASPW, cấy chuyển sang môi trƣờng chọn lọc thạch TCBS, chuyển vào tủ ấm 370
C.
Sau 18-24 giờ ủ bệnh, kiểm tra trên mặt đĩa TCBS. Hình thái thể hiện màu của Vibrio spp trên môi trƣờng TCBS đƣợc thể hiện nhƣ sau:
Vi khuẩn V. parahaemolyticus, vi khuẩn V. vulnificus, vi khuẩn V. mimicus thì nhẵn, màu xanh (sucrose (-)) và đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-3mm.
Vi khuẩn V. cholerae, vi khuẩn V. fluvialis thì nhẵn, màu vàng (sucrose (+)) và đƣờng kính từ 2-3mm.
Lấy 4-5 khuẩn lạc điển hình cấy thuần trên môi trƣờng TCBS lần 2, ủ 370C trong 18-24 giờ.
Sau đó tiến hành cấy chuyển sang môi trƣờng Saline Nutrient Agar (SNA) 2% NaCl ủ đĩa ở 370C trong 18-24 giờ, để kiểm tra đặc tính sinh hóa.
Hình 4: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp. bắt màu vàng trên môi trƣờng TCBS.
Hình 5: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp. bắt màu xanh trên môi trƣờng TCBS.
Sơ đồ 3: Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Vibrio spp. (ISO/TS 218722:2007)
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Vibrio spp.
Sau khi cấy chuyển trên môi trƣờng NA saline, những khuẩn lạc nghi vi khuẩn Vibrio spp. đƣợc chọn để tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa nhằm khẳng định chủng vi khuẩn Vibrio.
Kiểm tra đặc tính sinh hóa những khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp. đƣợc chọn qua các phản ứng với Oxidase, TSI, Indole, ODC, LDC, ADH, Peptone ở các nồng độ muối 0%, 2%, 6%, 8%, 10%.
Bắt 5 khuẩn lạc cấy thuần lại trên môi trƣờng TCBS Tăm bông có mẫu + 9ml canh tăng sinh ASPW
Dùng que cấy vòng cấy trên mặt thạch TCBS
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trƣờng SNA
Kiểm tra các đặc tính sinh hóa
(TSI, Indole, ODC, LDC, ADH, ONPG, Peptone 0; 2; 6; 8; 10% NaCl) Ủ 370 C 18-24h Ủ 370 C Ủ 370 C Ủ 370 C 18-24h 18-24h 18-24h Thử oxidase, nhuộm Gram
Xác định vi khuẩn Vibrio spp. Và cấy thuần lại trên SNA
Kháng sinh đồ và giữ giống
Ủ 370
Phản ứng kiểm tra với Oxidase
Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc từ môi trƣờng SNA đánh tan khuẩn lạc vào giọt nƣớc muối sinh lý đã nhỏ sẵn trên lam kính. Sau đó cho đĩa thuốc thử oxidase lên và quan sát màu của thuốc thử:
Phản ứng dƣơng tính: đĩa thuốc thử bắt màu xanh dƣơng hoặc tím. Phản ứng âm tính: vẫn giữ màu của đĩa thuốc thử oxidase.
Hình 6: Vi khuẩn Vibrio spp. dƣơng tính khi thử nghiệm oxidase (cho màu xanh tím).
Hình 7: Vi khuẩn Vibrio spp. âm tính khi thử nghiệm oxidase.
Môi trƣờng Saline Triple Sugar Iron agar (TSI)
Mục đích của việc cấy trên môi trƣờng này là kiểm tra tính lên men đƣờng glucose, lactose, tính sinh gas và tính sinh H2S của vi khuẩn.
Môi trƣờng TSI saline đƣợc pha chế có màu đỏ cam, hấp khử trùng sau khi đổ vào ống nghiệm, môi trƣờng đặt nghiêng, phần nghiêng cao tƣơng đƣơng phần đứng và chiều dài môi trƣờng đạt không qua 2/3 chiều cao ống nghiệm, tuyệt đối không để thạch chạm nắp ống nghiệm.
Trong điều kiện vô trùng, dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn Vibrio spp. nghi ngờ từ môi trƣờng SNA cấy thẳng xuống phần thạch đứng và phần thạch nghiêng ria cấy ngang, đem ủ ở 370C trong 24 giờ.
Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi đặc trƣng của môi trƣờng:
Vi khuẩn Vibrio spp. lên men đƣờng sucrose nên phần thạch đứng có màu vàng, phần thạch nghiêng màu đỏ, không sinh H2S, không sinh hơi (vi khuẩn V. cholerae, vi khuẩn V. fluvialis).
Vi khuẩn Vibrio spp. không lên men đƣờng sucrose và lactose nên phần thạch đứng và thạch nghiêng màu đỏ, không sinh hơi, không sinh H2S (vi khuẩn V. mimicus, vi khuẩn V. parahaemolyticus).
Vi khuẩn Vibrio spp. lên men lactose, không lên men sucrose nên phần thạch đứng có màu đỏ, phần thạch nghiêng màu vàng, không sinh hơi, không sinh H2S (vi khuẩn V. vulnificus).
Indole
Môi trƣờng có Tryptophan, vi khuẩn Vibrio spp. sẽ li giải Tryptophan thành Indole. Để nhận biết Indole ta nhỏ khoảng 1-2 giọt thuốc thử Kowacs, hợp chất Indole với thuốc thử Kowacs có vòng màu đỏ thì phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính.
Thử nghiệm decarboxylase
Các loài vi khuẩn đƣờng ruột khác nhau trong mức độ cảm ứng tạo thành các enzyme carboxylase có vai trò xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl ở một số acid amin tạo ra amine hoặc diamine và CO2. Các enzyme này chỉ đƣợc cảm ứng tổng hợp khi môi trƣờng có tính acid và chất cảm ứng đặc hiệu. Có 3 loại decarboxylase quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật là Lysine decarboxylase (LDC), Ornithine decarboxylase (ODC), và Arginine decarboxylase (ADC) có cơ chất tuần tự là lysine, ornithine và arginine.
Phản ứng xúc tác bởi LDC sẽ loại bỏ CO2 khỏi lysine, phóng thích CO2 và dẫn đến sự tạo thành cadaverine. Trƣờng hợp ODC và ADC sản phẩm tạo ra là CO2 và putrescine. Ngoài ra, arginine còn có thể đƣợc chuyển hóa thành citruline nhờ xúc tác của enzyme arginine dihydrolase (ADH) trƣớc khi chuyển hóa tiếp thành putrescine và CO2. Do vậy thử nghiệm arginine decarboxylase (ADC) cũng đƣợc kí hiệu là ADH. Trong tất cả các trƣờng hợp trên, CO2 sinh ra làm tăng pH của môi trƣờng và đƣợc ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH (Trần Linh Thƣớc, 2009).
Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Vibrio spp. nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa môi trƣờng ODC, LDC hay ADH, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi đặc trƣng của môi trƣờng.
ODC (Saline medium for detection of ornithine decarboxylase) Nếu màu môi trƣờng chuyển sang màu tím và đục sau khi ủ thì phản ứng dƣơng tính (có vi khuẩn phát triển và tách carboxyl từ ornithine), chuyển sang vàng thì phản ứng âm tính.
LDC (Saline medium for detection of lysine decarboxylase)
Sau khi ủ, quan sát thấy nếu môi trƣờng chuyển sang tím và đục thì phản ứng dƣơng tính (vi khuẩn phát triển và tách carboxyl từ lysine), chuyển sang vàng thì âm tính.
ADH (Saline medium for detection of arginine decarboxylase)
Môi trƣờng chuyển sang tím và đục thì dƣơng tính (vi khuẩn phát triển và khử hydro arginine), chuyển sang vàng thì âm tính.
Thử nghiệm β-galactosidase
Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp trong tế bào của hai enzyme là β-galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose và permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên trong tế bào. Một số vi khuẩn không có gen mã hóa enzyme β-galactosidase nên không thể lên men lactose. Hoạt tính của enzyme này có thể đƣợc xác định dựa vào một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG). Sự thủy phân của cơ chất đƣờng này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol có màu vàng (Trần Linh Thƣớc, 2009). Tăng sinh vi khuẩn Vibrio spp. trong môi trƣờng peptone kiềm, đem ủ tủ ấm 370C trong 4 giờ. Sau đó cho đĩa thuốc thử ONPG vào mỗi ống nghiệm và ủ ở 370
C trong 6 giờ và đọc kết quả. Nếu màu môi trƣờng chuyển sang vàng đậm cho kết quả dƣơng tính, không đổi màu cho kết quả âm tính.
Kiểm tra đặc tính sử dụng muối
Tùy vào từng loài vi khuẩn Vibrio spp. mà đặc tính sử dụng muối khác nhau. Chuẩn bị môi trƣờng peptone kiềm chứa các nồng độ muối khác nhau 0%, 2%, 6%, 8% và 10% NaCl. Trong điều kiện vô trùng, dùng que cấy, cấy vi khuẩn vào từng ống nghiêm và quan sát khả năng tăng trƣởng của vi khuẩn ở từng nồng độ muối. Đọc kết quả dựa vào độ đục của môi trƣờng: ống nghiệm đục cho kết quả dƣơng tính, ống nghiệm trong cho kết quả âm tính.
Vi khuẩn V. cholerae, vi khuẩn V. mimicus cùng phát triển tốt ở các nồng độ 0% và 2% NaCl, không phát triển đƣợc ở các nông độ 6%, 8% và 10% NaCl.
Vi khuẩn V. parahaemolyticus phát triển tốt ở các nồng độ 2%, 6% và 8% NaCl, không phát triển đƣợc ở các nông độ 0% và 10% NaCl.
Vi khuẩn V. vulnificus, vi khuẩn V. fluvialis cùng phát triển tốt ở các nồng độ 2% và 6% NaCl, không phát triển đƣợc ở các nông độ 0%, 8% và 10% NaCl.
Nhuộm Gram
Mục đích: giúp phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím và vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dáng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau. Vi khuẩn Vibrio spp. thuộc nhóm Gram (-) nên sau khi nhuộm và quan sát dƣới kính hiển vi sẽ thấy đƣợc vi khuẩn bắt màu hồng, hình que hơi cong.