Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
Rửa cột bằng áp suất thường: Dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cột
áp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn.
Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen
hoặc không khí) vào đầu cột. Tốc độ dòng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều chỉnh. Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột.
Việc lựa chọn các phương pháp giải ly cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột. Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly.
Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột. Tạp chất có trong dung môi thường làm thay đổi độ phân cực của dung môi sử dụng, do vậy người ta thường chưng cất dung môi trước khi sử dụng.
Hiện nay trên thị trường có bán loại silica gel đảo pha. Khi sử dụng silica gel này làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp phụ tỉ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký. Cho nên, pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước. Như vậy các thành phần phân cực trong hỗn hợp chất cần sắc ký sẽ được giải ly ra trước, thành phần không phân cực sẽ ra sau. Phương pháp này được ứng dụng rất hiệu quả đối với các hợp chất có độ phân cực mạnh trong thực vật như saponin.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột
gel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách sẽ không tốt.
Vận tốc chảy của dung môi rửa cột phải được điều chỉnh cho phù hợp; không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) cũng không được quá chậm hoặc cho dừng lại một thời gian dài vì sẽ làm cho chất tan bị khuếch tán, ảnh hưởng đến hiệu quả tách.
Tốc độ di chuyển của một chất trên mặt hấp phụ phụ thuộc vào dung môi. Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi .
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp SKLM.
Thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi tách tốt nhất. Khi chọn được chất hấp phụ và hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải ly tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành.
Chương 4: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xử lý nguyên liệu và định tính các nhóm chức
4.1.1 Xử lý nguyên liệu
Ba mẫu nấm Đông cô (Lentinula edodes) tươi, khô loại lớn và khô loại
nhỏ mua tại siêu thị Metro ngày 14/8/2013, đóng gói dạng bịt nilon 200 g. Được cắt nhỏ, phơi khô đến khối lượng không đổi và xay thành bột.
Hình 4.1: Nấm Đông cô tươi, khô loại lớn và khô loại nhỏ
Xác định độ ẩm của 3 loại nấm trên trong cùng điều kiện thu được kết quả như sau:
Bảng4.1: Bảng xác định độ ẩm
Mẫu nấm Khối lượng ban đầu Khối lượng sau sấy Độ ẩm
Nấm tươi (N1) 778 g 135 g 82,6% Nấm khô lớn (N2) 190 g 178 g 6,3% Nấm khô nhỏ (N3) 197 g 182 g 7,6% 4.1.2 Định tính các nhóm chức 4.1.2.1 Định tính alkaloid Định tính bằng thuốc thử Dragendrorff
Công thức: Dung dịch A: 8,0 g Bi(NO3)3.H2O + 25 mL HNO3 30%. Dung dịch B: 28 g KI + 1 mL HCl 6 N + 5 mL nước cất. Hỗn hợp hai dung dịch A và B, để yên trong tủ lạnh ở 5 °C cho tủa màu sậm và tan trở lại, sau đó lọc và thêm nước cất cho vừa đủ 100 mL thu được thuốc thử Dragendorff.
Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
Hình 4.2: Định tính alkaloid với thuốc thử Dragendrorff
Nhận xét: Cả 3 mẫu nấm đều có kết tủa màu cam, phản ứng dương tính.
Định tính bằng thuốc thử Mayer
Công thức: Dung dịch A: 1,36 g HgCl2 + 60 mL nước cất. Dung dịch B: 5 g KI + 10 mL nước cất.
Trộn dung dịch A và B, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, thu được thuốc thử Mayer.
Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Hình 4.3: Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer
Nhận xét: Có kết tủa màu trắng cả 3 mẫu nấm, phản ứng dương tính. Kết luận: Trong dịch chiết etanol có chứa alkaloid.
4.1.2.2 Định tính flavonoid
Công thức: Thuốc thử chì acetate (CH3COO)2Pb có tính kiềm, được pha bão hòa trong nước.
Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ dung dịch (CH3COO)2Pb vào ống nghiệm có dịch chứa flavol/etanol sẽ xuất hiện kết tủa keo màu trắng xanh. Thêm Na2SO4 vào ống nghiệm sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng của PbSO4 lắng xuống đáy còn kết tủa trắng xanh vẫn lơ lửng trong ống nghiệm.
Hình 4.4: Định tính flavonoid
Nhận xét:Có kết tủa trắng xanh, phản ứng dương tính. Kết luận: Có flavonoid trong dịch chiết.
4.1.2.3 Định tính steroid
Công thức: Hòa tan 1 – 2 mg mẫu thử trong 1 mL chloroform và nhỏ thêm 1 mL H2SO4 đậm đặc.
Dấu hiệu nhận biết: Phản ứng dương tính khi dung dịch đổi màu thành đỏ đậm, xanh, xanh − tím.
Hình 4.5: Định tính steroid
Nhận xét: Dung dịch chuyển sang màu xanh, phản ứng dương tính. Kết luận: Trong dịch chiết etanol có chứa steroid.
4.1.2.4 Định tính saponin
Thực hiện:
Ống nghiệm 1: 5 mL dung dich NaOH 0,1 N (pH = 13) + thêm 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Ống nghiệm 2: 5 mL dung dịch HCl 0,1 N (pH = 1) + thêm 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh, để yên 15 phút và quan sát cột bọt trong 2 ống nghiệm.
Dấu hiệu nhận biết: Có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin. Nhận xét: Cột bọt không bền ở cả 3 mẫu nấm.
Công thức: Felling A: CuSO4.
Felling B: Kali natri tartrat.
Cho vào ống nghiệm vài giọt Felling A, vài giọt Felling B theo tỉ lệ 1 : 1, lắc, xuất hiện màu xanh thẫm, thêm dung dịch mẫu thử rồi đem đun cách thủy. Dấu hiệu nhận biết: Nếu có đường khử sau một thời gian đun sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.
Hình 4.6: Định tính đuờng khử
Nhận xét: Sau khi đun ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch. Kết luận: Có đường khử trong dịch chiết của cả 3 mẫu.
4.1.2.6 Định tính tanin
Thuốc thử Stiasny
Công thức: 20 mL formol 36% + 10 mL HCl đậm đặc. Dấu hiệu nhận biết: Có trầm hiện màu đỏ.
Nhận xét: Không có hiện tượng, phản ứng âm tính. Kết luận: Không có tanin trong mẫu thử.
Từ những kết quả trên, tổng kết sự hiện diện các nhóm chức có trong dịch chiết ban đầu như sau: Có sự hiện diện của các alkaloid, flavonoid, terpene – steroid, glycoside, không có sự hiện diện của saponin và tanin. Bảng4.2: Kết quả định tính một số nhóm chức
Nhóm
chức Thuốc thử Hiện tượng
N1 N2 N3 Alkaloid Dragendrorff Kết tủa cam − nâu + + +
Mayer Kết tủa trắng + + +
Flavonoid (CH3COO)2Pb Kết tủa trắng xanh + + + Steroid Salkowski Dung dịch màu xanh + + + Glycoside Felling A, B Kết tủa đỏ gạch + + + Saponin Độ ổn định bọt Cột bọt không bền − − − Tanin Stiasny Không có trầm hiện đỏ − − −
4.2 Điều chế các loại cao
4.2.1 Điều chế cao etanol tổng (EtOH)
Cân chính xác khối lượng bột như nhau 3 loại nấm là 135 g và ngâm dầm với etanol 96o. Cô quay thu hồi dung môi, cân và xác định hiệu suất thu cao. Bảng4.3: Khối lượng cao tổng và hiệu suất thu cao tổng
Nấm tươi Nấm khô lớn Nấm khô nhỏ
Bột ngâm (g) 135 135 135
Cao EtOH (g) 54,78 43,69 48,33
Hiệu suất (%) 40,58 32,36 35,8
4.2.2 Điều chế cao thành phần
4.2.2.1 Điều chế cao petroleum ether (PE)
Từ cao etanol tổng, pha với nước cất và chiết lỏng − lỏng với petroleum ether (trích bằng bình lóng nhiều lần thu lớp dung dịch ở phần trên cho tới khi nhỏ một giọt trên tấm kính sạch thấy không còn để lại vết thì ngưng).
Cô quay thu hồi dung môi và tính hiệu suất thu cao PE. Bảng4.4: Khối lượng cao PE và hiệu suất thu cao
Nấm tươi Nấm khô lớn Nấm khô nhỏ
Cao PE (g) 2,6039 1,5023 4,6248
Hiệu suất thu cao (%) 4,75 3,44 9,57
4.2.2.2 Điều chế cao ethyl acetate (Cao Ea)
Phần dung dịch lớp dưới sau khi được trích với ether dầu hỏa tiếp tục chiết lỏng – lỏng với etyl acetate (trích bằng bình lóng nhiều lần, thu lớp trên cho tới khi nhỏ một giọt trên tấm kính sạch bay hơi hết dung môi không còn để lại vết).
Cô quay thu hồi dung môi, cân khối lượng và tính hiệu suất thu cao. Bảng4.5: Khối lượng cao Ea và hiệu suất thu cao
Nấm tươi Nấm khô lớn Nấm khô nhỏ
Cao Ea (g) 0,45 0,45 0,4
Hiệu suất thu cao (%) 0,82 1,03 0,83
4.2.2.3 Điều chế cao n−butanol (Cao n−BuOH)
Phần dung dich lớp dưới sau khi chiết với etyl acetate tiếp tục được chiết lỏng – lỏng với n−butanol (tương tự trích nhiều lần với bình lóng và lấy lớp dung dịch ở trên).
Bảng4.6: Khối lượng cao n−butanol và hiệu suất thu cao
Nấm tươi Nấm khô lớn Nấm khô nhỏ
Cao n−BuOH (g) 20,9 10,06 5
Hiệu suất thu cao (%) 38,15 23,03 10,35
Hình 4.7: Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các loại cao
Bột nấm 135 g
- Chiết lỏng – lỏng với
n−butanol, lấy lớp trên
- Cô quay, thu hồi dung môi Cao etanol tổng Lớp dưới Cao PE Phần dịch nước Cao Ea Cao n−BuOH Lớp dưới
- Ngâm trong etanol 96o - Cô quay, thu hồi dung môi
- Chiết lỏng – lỏng với PE, lấy lớp trên - Cô quay, thu hồi dung môi
- Chiết lỏng – lỏng với Ea, lấy lớp trên - Cô quay, thu hồi dung môi
4.2.3 So sánh khối lượng cao
Từ những kết quả trên nhận thấy hiệu suất thu cao tổng đối với nấm tươi lớn nhất, tiếp theo là nấm khô nhỏ cuối cùng là nấm khô lớn.
Cao petroleum ether thường chứa các hydrocacbon béo và thơm (alkane mạch dài, triglyceride, alcol béo, ester béo, acid béo,…), terpene, sterol,… Khảo sát nhận thấy nấm khô nhỏ có khối lượng cao PE lớn nhất, nấm tươi thứ hai, cuối cùng là nấm khô lớn.
Cao etyl acetate thường chứa các aglygon do hợp chất glycoside bị thủy giải, monoglycoside, một số loại alkaloid loại bazo yếu,… Khảo sát nhận thấy khối lượng cao etyl acetate của 3 loại nấm là như nhau.
Cao n−butanol chứa alkaloid ở dạng muối tứ cấp kết hợp acid hữu cơ, muối amin, các hydrocacbon có trọng lượng phân tử nhỏ monosaccharide, oligosaccharide, một số polysaccharide, protein, muối vô cơ,… Khảo sát 3 loại nấm nhận thấy khối lượng cao n−butanol ở nấm tươi là cao nhất, tiếp theo là nấm khô lớn, nấm khô nhỏ [18].
Bảng4.7: Bảng tổng kết khối lượng các cao thu được
Nấm tươi Nấm khô lớn Nấm khô nhỏ
Bột ngâm (g) 135 135 135
Cao tổng EtOH (g) 54,7813 43,69 48,33
Cao PE (g) 2,6039 1,5023 4,6248
Cao Ea (g) 0,45 0,45 0,4
Cao n−BuOH (g) 20,9 10,06 5
4.3 Phân lập hợp chất có trong cao PE 4.3.1 Quá trình phân lập chất trên cao PE 4.3.1 Quá trình phân lập chất trên cao PE
Cao PE của nấm tươi được điều chế từ cao tổng etanol trong quá trình chiết lỏng − lỏng với petroleum ether.
Tiến hành sắc ký cột với cao PE, dung môi khởi đầu giải ly PE 100%, sau đó tăng dần PE : Ea theo tỷ lệ sau 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3, 6 : 4, 5 : 5, 4 : 6, 3 : 7, 2 : 8, 1 : 9, Ea.
Đường kính và chiều dài cột: d = 2 cm, l = 40 cm. Khối lượng mẫu: 2 g.
hứng thể tích mỗi lọ 10 ml, tiến hành SKLM đồng thời để theo dõi quá trình giải ly. Gom những phân đoạn giống nhau. Thuốc thử hiện hình H2SO4 10%. Bảng4.8: Kết quả sắc ký cột cao PE nấm tươi
Phân đoạn Kết quả SKLM Hệ SKLM Khối lượng (g) I 1 vết vàng, 1 vết nâu, 1 vết xanh PE : Ea 8 : 2 0,519 II 1 vết nâu, 1 vết xanh PE : Ea 8 : 2 0,412 III 2 vết Rf gần nhau PE : Ea 6 : 4 0,020 IV 1 vết dơ PE : Ea 6 : 4 0,035 V 2 vết mờ màu vàng Ea 0,086
Tổng khối lượng các phân đoạn của cao PE: 1,072 g
Thu suất quá trình sắc ký cột cao PE: .100 53,6% 2 072 , 1 H
Nhận xét: Qua trình tách sắc ký trên cao PE thu được 5 phân đoạn. Trong đó phân đoạn I các vết tương đối rõ, có khối lượng tương đối nhiều hơn các phân đoạn khác nên tiếp tục sắc ký lần 2 với phân đoạn I.
4.3.2 Quá trình phân lập chất trên phân đoạn I cao PE
Phân đoạn I có khối lượng m = 0,519 g, có 3 vết rõ: 1 vết màu vàng, 1 vết màu nâu và 1 vết màu xanh. Sắc ký cột lần 2 với mong muốn phân lập được chất tinh khiết.
Đường kính và chiều dài cột: d = 1 cm, l = 45 cm. Khối lượng silica gel: 10 g.
Dung môi khởi đầu là PE, tăng dần PE : Ea theo tỷ lệ 99 : 1, 98 : 2, 97 : 3, 96 : 4, 95 : 5, 94 : 6, 93 : 7, 92 : 8, 91 : 9, 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3. SKLM với hệ dung PE : EA = 8 : 2 gom chung phân đoạn giống nhau.
Bảng4.9: Kết quả sắc ký cột phân đoạn I
Phân đoạn Kết quả SKLM Dạng chất Khối lượng (g) I1 1 vết còn lẫn tạp Sáp có màu xanh 0,026
I2 Vết tạp Sáp màu vàng 0,029
I3 2 vết dơ Tinh thể trắng 0,093
I4 1 vết nâu Tinh thể trắng 0,109
Khối lượng tổng cộng các phân đoạn I: 0,395 g.
Thu suất quá trình sắc ký cột cao PE: .100 76,1% 519 , 0 395 , 0 H . Hình 4.8: SKLM phân đoạn I, I4 và I5 Phân đoạn I4
Sau khi sắc ký lần 2 được phân đoạn I4 chất dạng timh thể màu trắng tương đối sạch. SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau được vết gọn và không lẫn tạp, tạm gọi chất này là PHUOC_NS1, tôi quyết định chọn gửi phổ.
Hình 4.9: SKLM hợp chất PHUOC_NS1 với 3 hệ dung môi khác nhau
Phân đoạn I5:
Sau khi sắc ký lần 2 được phân đoạn I5, chất dạng tinh thể màu trắng tương đối sạch. Khảo sát với 3 hệ dung môi khác nhau thu được vết gọn, không lẫn tạp chất. Không có hoạt tính UV ở bước sóng 254 nm và 356 nm. Tạm gọi là PHUOC_NS2 và gửi phổ chất này.
Ba hệ dung môi:
Bảng 1: PE : C = 1 : 1 Bảng 2: DC
Hình 4.10: SKLM hợp chất PHUOC_NS2 với 3 hệ dung môi khác nhau
4.3.3 Biện luận cấu trúc hợp chất vừa phân lập 4.3.3.1 Hợp chất PHUOC_NS1 4.3.3.1 Hợp chất PHUOC_NS1
Các tín hiệu vùng từ trường thấp δ ppm 5,38 (1H, m, H6); 5,57 (1H, m, H7); tín hiệu δ ppm ở 5,18 (1H, dd, J = 15,2 Hz; J = 8 Hz, H22); 5,22 (1H, dd,
J = 15,2 Hz; J = 8 Hz, H23); tín hiệu δ ppm 3,63 (1H, m, H3).
Các tín hiệu ở vùng từ trường cao δ ppm 0,79 (3H, s, H18); 0,94 (1H, s, H19); 1,04 (3H, d, J = 7 Hz, H21); 0,83 (3H, d, J = 7 Hz, H26); 0,84 (3H, d, J