3.4.1 Giới thiệu chung
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography (TLC)) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ như silica gel hay oxit alumin. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.
Muốn thực hiện sắc ký, người ta cho mẫu phân tích hòa tan vào trong một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm 1 vết nhỏ gọn lên lớp mỏng. Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẫu, như vậy mẫu chỉ còn là dạng bột khô bám trên lớp mỏng. Đặt lớp mỏng theo chiều thẳng đứng vào trong một bình có dung môi thích hợp, dung môi sẽ bị lực mao quản hút lên phía trên, mẫu chất sẽ được phân chia thành những vết riêng biệt. Các vết sẽ được phát hiện bằng phương pháp vật lý như nhìn bằng mắt, soi dưới đèn tử ngoại hoặc bằng phương pháp hóa học [18-21].
Một chất tinh khiết chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định. Trị số Rf được tính như sau:
Hình 3.2: Cách tính giá trị Rf
Rf luôn có giá trị nhỏ hơn 1 và thay đổi tùy thuộc vào điều kiện tiến hành: Tính chất của chất hấp phụ.
Thành phần của dung môi triển khai. Chiều dày của bảng mỏng.
Lượng mẫu chất chấm. Nhiệt độ.
Điều kiện bão hòa khí quyển.
Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm sau: Thời gian tiến hành nhanh.
Lượng mẫu phân tích nhanh. Dụng cụ đơn giản
Hiệu ứng tách tốt hơn so với các phương pháp khác.
Có thể phân tích đồng thời mẫu chất và chất chuẩn trong cùng điều kiện.
3.4.2 Chất hấp phụ silica gel
Trong SKLM, thường dùng các chất hấp phụ: silica gel, Al2O3, cellulose, Kieselguhr,… Ngoài ra người ta còn trộn thêm chất kết dính hoặc chất chỉ thị phát huỳnh quang. Chất kết dính giúp chất hấp phụ bám tốt vào tấm kính hoặc plastic, làm cho lớp mỏng bền, không bị trầy xước.
Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất. Silica gel được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký, chế tạo bằng cách thủy giải natri silicate (cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt,... Ngoài ra người ta còn bổ sung thêm các hợp chất khác vào silica gel để tăng khả năng tách theo
đó có trộn thêm chất kết dính sulfat canxi ngậm nước CaSO4.0,5H2O. Sự hiện diện của ion canxi hầu như không ảnh hưởng đến quá trình sắc ký.
Si O H O O O Si O H O Si O H O O Si O H O O O
Hình 3.3: Cấu trúc mạng silica gel
Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm –Si−OH, đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất được sắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang nhóm chức –OH, −NH2, −COOH,...) có khả năng tạo mối hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như alkane, terpene (là những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm [18].
3.4.3 Dung môi giải ly
Dung môi triển khai trong SKLM thường là một hỗn hợp có 2, 3 hoặc 4 loại dung môi khác nhau với tỉ lệ thích hợp. Ứng với mỗi loại hợp chất khác nhau sẽ có hệ dung môi thích hợp.
Nên chọn dung môi có độ tinh khiết cao, hòa tan được mẫu phân tích. Tuy nhiên không khuyến khích dùng dung môi có thể hòa tan tuyệt đối mẫu. Mẫu chất cần phân tích có thể chứa nhiều chất khác nhau, khả năng tách riêng các chất trong mẫu tùy thuộc vào tỷ lệ phân bố của các chất giữa chất hấp phụ và dung môi triển khai. Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay đổi thành phần dung môi hoặc thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi trong hỗn hợp dung môi khai triển.
Với mẫu chất chưa biết thành phần hợp chất, chưa có tài liệu tham khảo phải làm một loạt thí nghiệm với các hệ dung môi khác nhau, quan sát các vết, một hệ dung môi triển khai phù hợp khi các vết Rf rõ, cách xa và trong giới hạn từ 0,3 đến 0,7. Nếu Rf nhỏ hơn 0,3 thì hệ dung môi chưa đủ phân cực, Rf lớn hơn 0,7 thì hệ dung môi quá phân cực [18, 21].
3.4.4 Các kỹ thuật SKLM 3.4.4.1 Kỹ thuật SKLM 1 chiều 3.4.4.1 Kỹ thuật SKLM 1 chiều
Dung môi chạy theo một chiều từ đầu dưới bảng mỏng lên đầu trên bảng mỏng. Lưu ý vết chấm ban đầu trên bảng mỏng không được ngập trong dung môi khi khai triển, mẫu chất sẽ khuyếch tán ngay ra dung môi làm cho các vết bị lem.
3.4.4.2 Kỹ thuật SKLM 2 chiều
Trong trường hợp mẫu phân tích có nhiều cấu tử, kỹ thuật SKLM 1 chiều không đủ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật SKLM 2 chiều để kết quả tách được rõ ràng hơn.
Dùng loại bảng 20 20, chấm chất phân tích ở góc bảng cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi thứ I, quay góc 90o, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi thứ II.
Hình 3.4: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 2 chiều
3.4.4.3 Kỹ thuật SKLM điều chế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SKLM điều chế còn được gọi là kỹ thuật sắc ký chế hóa, thường để tách các chất với lượng nhỏ, có Rf xa nhau.
Dùng kỹ thuật SKLM 1 chiều, bảng mỏng có kích thước 20 × 20 cm, độ dày chất hấp phụ từ 0,5−1 mm.
Hỗn hợp cần tách được chấm thành 1 đường liên tục trên bảng mỏng. Sau đó triển khai bằng hệ dung môi thích hợp. Trường hợp Rf các chất trong hỗn hợp gần nhau, có thể tiến hành khai triển nhiều lần, mỗi lần phải sấy khô bảng mỏng.
lên mé của bảng mỏng, tránh phun 1 vùng quá rộng vì thuốc thử có thể làm biến đổi cấu trúc của cấu tử cần tách để tạo phản ứng màu.
Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng từng vùng.
Dùng dung môi thích hợp (có thể dùng dung môi khai triển) để lấy riêng mẫu chất ra khỏi chất hấp phụ, quá trình này gọi là phản hấp phụ [21].
Hình 3.5: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế
3.4.5 Ứng dụng của SKLM
Kỹ thuật sắc SKLM hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên.
- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập được. - Kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không.
- Tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát. - Chuẩn bị cho việc sắc ký cột.
- Theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ. - Kiểm tra một hợp chất có kém bền.
- Cô lập hợp chất (SKLM điều chế).
3.5 Sắc ký cột
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong 1 ống hình trụ bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ được gọi là “cột”. Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion). Ở đây chỉ trình bày sắc ký cột hấp phụ [18-21].
3.5.1 Nguyên tắc
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.
Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của chất đó đối với dung môi rửa cột mà được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhôm, silica gel, CaCO3 , than hoạt tính, polyamid,… Silica gel là pha tĩnh được dùng rộng rãi nhất để tách các hợp chất thiên nhiên.
Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần.
Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ. Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ được nối với một ống cao su, dùng khóa kim loại để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi. Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.
3.5.2 Kỹ thuật triển khai 3.5.2.1 Chuẩn bị cột 3.5.2.1 Chuẩn bị cột
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). - Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất.
Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Trọng lượng chất phân tích
Trọng lượng chất hấp phụ
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,….
Có 2 cách nhồi cột: Nhồi cột ướt và nhồi cột khô. Tỷ lệ = (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
silica gel, sephadex,… phải ngâm trong dung môi một thời gian trước khi cho vào cột để tránh làm nứt cột. Lắc và trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng và không được để khô dung môi trong cột. Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn tòan ổn định. Giữ cho mặt thoáng trên cột phẳng, tránh làm xáo trộn bề mặt silica gel.
Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở
như Al2O3, CaCO3,... Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phểu có cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều xung quanh cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều. Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định và không được để khô dung môi trong cột.
3.5.2.2 Đưa chất phân tích vào cột
Chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng. Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:
Cho trực tiếp dung dịch mẫu lên cột: Hòa tan chất cần phân tích vào một
lượng vừa đủ dung môi (càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo hòa tan hoàn toàn. Dung dịch mẫu có nồng độ đậm đặc mới nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột. Cột đã ổn định được tháo dung môi cho đến khi mặt thoáng gần sát bề mặt chất hấp phụ thì khóa vòi lại. Dùng ống hút, hút dung dịch đậm đặc chất cần phân tích chảy dọc thành cột. Mở khóa bên dưới cho dịch mẫu ngấm vào cột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung dịch mẫu đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột, cho dung môi ngấm hết vào cột. Tiếp đến là cho dung môi để bắt đầu tiến hành quá trình giải ly.
Trộn với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với một
lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột.
Nhận xét: Trong 2 cách trên, cách cho trực tiếp dung dịch mẫu lên cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau:
- Chất phân tích hoà tan hoàn toàn.
- Dung dịch chất phân tích phải nạp vào cột đều.
- Khi toàn chất phân tích đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi. - Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu mẫu chất
ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau chứng tỏ kỹ thuật được đảm bảo.
3.5.3 Quá trình giải ly cột
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
Rửa cột bằng áp suất thường: Dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cột
áp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn.
Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen
hoặc không khí) vào đầu cột. Tốc độ dòng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều chỉnh. Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột.
Việc lựa chọn các phương pháp giải ly cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột. Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly.
Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột. Tạp chất có trong dung môi thường làm thay đổi độ phân cực của dung môi sử dụng, do vậy người ta thường chưng cất dung môi trước khi sử dụng.
Hiện nay trên thị trường có bán loại silica gel đảo pha. Khi sử dụng silica gel này làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp phụ tỉ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký. Cho nên, pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước. Như vậy các thành phần phân cực trong hỗn hợp chất cần sắc ký sẽ được giải ly ra trước, thành phần không phân cực sẽ ra sau. Phương pháp này được ứng dụng rất hiệu quả đối với các hợp chất có độ phân cực mạnh trong thực vật như saponin.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột
gel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách sẽ không tốt.
Vận tốc chảy của dung môi rửa cột phải được điều chỉnh cho phù hợp; không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) cũng không được quá chậm hoặc cho dừng lại một thời gian dài vì sẽ làm cho chất tan bị khuếch tán, ảnh hưởng đến hiệu quả tách.
Tốc độ di chuyển của một chất trên mặt hấp phụ phụ thuộc vào dung môi. Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi .
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên