3.5.2.1 Chuẩn bị cột
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). - Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất.
Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Trọng lượng chất phân tích
Trọng lượng chất hấp phụ
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,….
Có 2 cách nhồi cột: Nhồi cột ướt và nhồi cột khô. Tỷ lệ =
silica gel, sephadex,… phải ngâm trong dung môi một thời gian trước khi cho vào cột để tránh làm nứt cột. Lắc và trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng và không được để khô dung môi trong cột. Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn tòan ổn định. Giữ cho mặt thoáng trên cột phẳng, tránh làm xáo trộn bề mặt silica gel.
Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở
như Al2O3, CaCO3,... Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phểu có cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều xung quanh cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều. Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định và không được để khô dung môi trong cột.
3.5.2.2 Đưa chất phân tích vào cột
Chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng. Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:
Cho trực tiếp dung dịch mẫu lên cột: Hòa tan chất cần phân tích vào một
lượng vừa đủ dung môi (càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo hòa tan hoàn toàn. Dung dịch mẫu có nồng độ đậm đặc mới nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột. Cột đã ổn định được tháo dung môi cho đến khi mặt thoáng gần sát bề mặt chất hấp phụ thì khóa vòi lại. Dùng ống hút, hút dung dịch đậm đặc chất cần phân tích chảy dọc thành cột. Mở khóa bên dưới cho dịch mẫu ngấm vào cột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung dịch mẫu đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột, cho dung môi ngấm hết vào cột. Tiếp đến là cho dung môi để bắt đầu tiến hành quá trình giải ly.
Trộn với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với một
lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột.
Nhận xét: Trong 2 cách trên, cách cho trực tiếp dung dịch mẫu lên cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau:
- Chất phân tích hoà tan hoàn toàn.
- Dung dịch chất phân tích phải nạp vào cột đều.
- Khi toàn chất phân tích đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi. - Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu mẫu chất
ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau chứng tỏ kỹ thuật được đảm bảo.