Tiếp tục khảo sát khả năng hòa tan các nguồn lân khác nhau của các dòng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp phospho-molybdate blue (Murphy và Riley, 1962). Tiến hành thí nghiệm với 2 nguồn lân là: Ca3(PO4)2 và apatite (Ca5(PO4)3OH). Hàm lượng lân hòa tan sẽ được xác định bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880nm.
Ø Chuẩn bị mẫu:
- Chuẩn bị vi khuẩn gốc: nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng trên máy ủ lắc (350 vòng/phút) trong 2 ngày.
- Chủng 1ml vi khuẩn gốc vào các ống falcon có chứa 30ml môi trường NBRIP lỏng chứa một nguồn lân chính, ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc, sau đó tiến hành đo lượng lân hòa tan ở các ngày 5, 10, 15 và 20 ngày sau khi chủng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Ø Chuẩn bị hóa chất: (Cao Ngọc Điệp, 2011)
- Dung dịch A:
(1): 12g (NH4)6MoO24.4H2O (Amoniummolybdate) + 250ml H2O. (2): 0,2908g KsbOC4H2O6 (Potassium antymonyl tartrate) + 100ml H2O.
d (khuẩn lạc) + D (vòng sáng) PSI =
(3): thêm từ từ 140ml H2SO4 đậm đặc vào 1 lít H2O.
(4): cho (1) và (2) vào (3) sau đó thêm nước vào cho đủ 2 lít.
- Dung dịch B: cân 1,05g acid ascorbic cho vào 200ml dung dịch A.
Ø Dựng đường chuẩn lân:
- Chuẩn bị dung dịch P2O5 dùng làm dung dịch lân chuẩn. Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và hàm lượng P2O5 thì cần thiết lập phương trình tương quan giữa 2 chỉ số đó bằng dãy nồng độ P2O5 10mg/l.
- Thực hiện phản ứng màu molybdate ở các nồng độ P2O5 như sau:
§ Chuẩn bị 6 ống nghiệm 20ml, đánh dấu theo thứ tự 0-1-2-3-4-5; cho
vào mỗi ống 5ml nước khử khoáng.
§ Thêm 0-0,5-1,0-1,5-2-2,5ml dung dịch lân chuẩn có nồng độ P2O5
10mg/l vào các ống nghiệm theo thứ tự trên.
§ Thêm 4ml dung dịch B và 3,5-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0ml nước vào ống
theo thứ tự trên, trộn đều dung dịch bằng máy vortex. Ống số 0 là đối chứng âm. Khi đó đường chuẩn với nồng độ P2O5 các ống theo thứ tự là 0-5-10-15-20-25mg/l.
§ Để ổn định 15 - 20 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành đo OD ở bước sóng 880nm.
Ø Xác định lượng lân hòa tan có trong mẫu vi khuẩn:
- Lấy 1ml mẫu được nuôi ở các thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
- Hút 0,5ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước khử khoáng. - Thêm 4ml dung dịch B và 3ml nước vào mỗi ống, trộn đều dung dịch
bằng máy vortex.
- Để ổn định 15 - 20 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành đo OD ở bước sóng 880nm.
- Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng P2O5 được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 880nm (OD880nm).
- Sử dụng giá trị đo OD của ống 0 (không có P2O5, không có màu xanh) làm mẫu đối chứng âm, đưa giá trị OD về 0 (blank) để tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại của đường chuẩn. Sáu ống nghiệm 0, 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với giá trị OD tăng dần tỉ lệ với hàm lượng P2O5 có trong dung dịch.
- Kết quả đo OD của đường chuẩn lân được vẽ thành đồ thị trên Excel với trục tung là giá trị OD, trục hoành là hàm lượng P2O5 từ 0 đến 25mg/l.
- Kết quả OD của các dòng vi khuẩn được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn từ đó tính được lượng lân hòa tan sinh ra.
Phương trình đường chuẩn có dạng:
Trong đó:
y: kết quả đo OD của các dòng vi khuẩn
x: hàm lượng P2O5 hòa tan cần xác định (mg/l).