Đoàn Chiến Thắng (2010) đã tuyển chọn được 6 dòng vi sinh vật (3 dòng vi khuẩn và 3 dòng xạ khuẩn) có khả năng hòa tan phosphate khó tan mạnh nhất trong số 17 dòng phân lập được từ đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak.
Nguyễn Hữu Hiệp và Hà Danh Đức (2009) đã phân lập được 35 dòng vi khuẩn hòa tan lân từ đất và nốt rễ cây đậu phộng, khi kết hợp với vi khuẩn
Bradyrhizobium giúp thay thế 50kg N/ha và 60kg P2O5/ha.
Nguyễn Ngọc Nga (2008) nghiên cứu cho thấy khi kết hợp dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum và vi khuẩn hòa tan lân có thể giúp tiết kiệm 45kg N/ha và 15kg P2O5/ha.
Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp (2011) đã phân lập được 49 dòng vi khuẩn từ rễ, thân, lá của cây khóm trồng trên đất phèn huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang. Trong đó, giải trình tự được 9 dòng tương đồng với vi khuẩn Burkholderia
đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA.
Đặng Huỳnh Mai (2001) đã phân lập được 12 dòng nấm và 15 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân vô cơ (CaHPO4 và Ca5(PO4)3OH) từ đất.
Huỳnh Thị Hồng Phượng (2011) đã phân lập được 29 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây mía. Trong đó có 24 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP mạnh nhất. Đồng thời, bằng phương pháp giải trình tự 16S – rDNA đã xác định được một dòng là dòng vi khuẩn Burkholderia unamae. Đây là dòng vi khuẩn
Burkholderia nội sinh được tìm thấy đứng thứ 2 chỉ sau dòng Burkholderia vietnamiensis (nội sinh ở lúa) được tìm thấy ở miền Nam, Việt Nam (Gillis et al., 1995; Van et al., 2000).
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Mít (2007) đã cho thấy hiệu quả của phân vi sinh chứa G.diazotrophicus và P. stutzeri là gia tăng năng suất cây mía tương đương với việc bón 200kg N, 90kg P2O5 phân hóa học.
Nguyễn Thị Dơn et al. (2012) đã phân lập được 26 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan cả K và P từ mẫu vật liệu phong hóa núi Sập, tỉnh An Giang. Trong đó có 4 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân cao nhất và có mức độ đồng hình với các chi Bacillus, Brevibacillus, Acinetobacter soli.
Ok-Ryul (2008) đã phân lập được dòng vi khuẩn Burkholderia cepacia DA23 từ đất trồng có khả năng hòa tan lượng lân là 345,9mg/l khi sử dụng glucose 3% là nguồn carbon chính.
Luvizotto et al. (2010) cho biết rằng loài Burkholderia có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA trong khoảng 3,43 – 19,47µg/ml riêng đối với dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ là 3,43 – 9,97µg/ml, hòa tan lân khó tan với chỉ số PSI nằm trong khoảng 1,11 – 6,0.
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian
Từ tháng 07/2013 đến tháng 12/2013.
3.2. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.3. Phương tiện nghiên cứu
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị
- Đĩa petri, ống nghiệm, falcon, bình tam giác, ống đong. - Que cấy, que trải thủy tinh, cối, chày, cốc thủy tinh, đèn cồn. - Kính hiển vi quang học, lame, lamelle.
- Cân điện tử, máy đo pH, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy li tâm, máy li tâm lạnh - Tủ cấy, tủ ủ, máy lắc mẫu, microwave, máy đo OD, máy khuấy từ.
- Micropipet, đầu col, eppendorf… và một số thiết bị, dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm.
3.3.2. Vật liệu, hóa chất
a. Vật liệu
Các mẫu khoai lang và mẫu đất vùng rễ được thu thập tại huyện Bình Tân, Bình Minh tỉnh Vĩnh Long, huyện Lấp Vò - Đồng Tháp, huyện Trà Cú - Trà Vinh.
b. Hóa chất Hóa chất dùng khử trùng mẫu: - Nước rửa chén - Nước cất khử trùng - Tween 20 - Cồn 70o - H2O2
Hóa chất dùng định lượng lân hòa tan bằng phương pháp so màu Oniani: (NH4)6MoO24.4H2O, KsbOC4H2O6, H2SO4 đậm đặc, acid ascorbic, dung dịch lân chuẩn (P2O5).
Hóa chất dùng định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski: Thuốc thử Salkowski (R2): H2SO4, FeCl3, dung dịch IAA chuẩn.
Hóa chất dùng để quan sát và nhuộm Gram vi khuẩn: Nuớc cất khử trùng, cồn 70º, Iod, Fushin, Crystal violet.
Hóa chất dùng trong các môi trường như sau:
Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP (Nautiya et al., 1999)
Hóa chất Nồng độ (g/l) Sucrose Ca3(PO4)2 MgCl2.6H2O MgSO4.7H2O KCl (NH4)2SO4 10 5 0,5 0,25 0,2 0,1 Bromothylmol Blue 0,5% trong KOH 0,2N 6ml
Agar Môi trường đặc: 18
Ph 7,2
Bảng 4. Công thức môi trường LB (Sambrook et al., 1989)
Hóa chất Nồng độ (g/l) Trypton Dịch trích nấm men NaCl 10 5 10 pH 7,0
Bảng 5. Môi trường Burk’s (Park et al., 2005) không đạm Hóa chất Nồng độ (g/l) Sucrose K2HPO4 KH2PO4 Na2SO4 CaCl2 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O 10 0,52 0,41 0,05 0,2 0,1 0,005 0,0025 pH 7,0
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu
a. Thu thập mẫu
- Lấy một đoạn dây khoai lang khoảng 20g, bao gồm cả rễ, thân, lá và khoảng 20g đất vùng rễ khoai lang. Mẫu được chứa trong túi nilon sạch, riêng dây khoai lang được chứa trong túi nilon có đựng sẵn gòn thấm nước để giữ cho dây khoai lang được tươi.
- Ghi lại địa điểm từng nơi lấy mẫu, ngày thu mẫu sau đó đem về phòng thí nghiệm.
b. Xử lý mẫu
v Đối với dây khoai lang:
- Sau khi lấy mẫu về phòng thí nghiệm, rửa sạch đất bám trên dây khoai lang. Chia làm 3 phần: rễ, thân, lá.
- Cắt mẫu thân thành những đoạn dài khoảng 2 – 3cm; mẫu rễ, lá có thể không cắt nhỏ thêm, rửa thật sạch dưới vòi nước chảy.
- Để mẫu khô bớt nước sau đó tiếp tục quy trình khử trùng mẫu trong tủ cấy vô trùng.
- Rửa lại bằng nước cất khử trùng 3 lần. - Ngâm mẫu trong cồn 70o khoảng 5 phút. - Rửa lại bằng nước cất khử trùng 3 lần. - Ngâm mẫu trong H2O2 khoảng 3 phút.
- Rửa lại bằng nước cất khử trùng khoảng 5 – 6 lần.
v Đối với đất vùng rễ khoai lang:
- Loại bỏ những rác bẩn trong đất.
- Cân 10g đất + 90ml nước cất cho vào bình tam giác đã khử trùng. - Đặt mẫu trên máy khuấy từ để trộn đều trong 60 phút.
- Để mẫu lắng trong 30 phút.
Ø Lưu ý: Những mẫu chưa sử dụng ngay thì rửa sạch và trữ trong tủ lạnh 4 – 8oC.
3.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
a. Phân lập vi khuẩn
- Đối với mẫu đất vùng rễ, sau khi để lắng 30 phút, phần dịch trong ở phía trên sẽ được lấy để tiến hành phân lập vi khuẩn. Đối với mẫu dây khoai lang: Sau khi xử lý mẫu, dùng cối, chày (đã khử trùng nhiệt ướt) nghiền nhỏ mẫu để vi khuẩn thoát ra ngoài, thêm 2 – 5ml nước cất đã khử trùng vào, khuấy đều và ép mạnh, để lắng khoảng 2 phút và thu lấy dịch mẫu. Các bước tiếp theo làm tương tự cho mẫu dây khoai lang và mẫu đất.
- Hút lấy phần dịch mẫu cho vào eppendorf và tiến hành pha loãng mẫu đến 10-1, 10-2, 10-3 lần.
- Hút 30µl dịch mẫu ở các mức pha loãng cho vào môi trường NBRIP đặc và trải mẫu. Ủ mẫu ở 28 - 30oC.
- Quan sát mẫu hàng ngày và tiến hành cấy chuyền nhiều lần để tách ròng các dòng vi khuẩn.
- Khi thấy vi khuẩn đã ròng thì cấy trữ trên môi trường đặc tương ứng. Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi và nhuộm Gram.
Cách phân lập vi khuẩn:
ØTrải dịch nghiền mẫulên môi trường đặc trong đĩapetri (trải mẫu):
- Dùng micropipet vô trùng nhỏ 30µl dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên bề mặt của môi trường trong đĩa petri.
- Dùng que trải thủy tinh dàn đều giọt dịch mẫu trên toàn bộ bề mặt môi trường trong đĩa (hơ que thủy tinh dưới ngọn lửa đèn cồn trước mỗi lần trải mẫu).
- Đậy nắp đĩa petri, úp ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 48 - 72h.
Ø Phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng:
- Sau khi xuất hiện những khuẩn lạc rời trên đĩa petri, dùng que cấy đã khử trùng chấm nhẹ vào một khuẩn lạc để cấy chuyền sang đĩa petri mới chứa sẵn môi trường. Dựa vào đặc điểm khác nhau của các khuẩn lạc mọc trên đĩa khi quan sát bằng mắt thường để cấy chuyền nhằm được các dòng vi khuẩn khác nhau.
- Hé mở nắp đĩa petri, chấm nhẹ que cấy để loại bớt tế bào. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch theo đường zích zắc hay các đường thẳng song song. Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường zích zắc sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các khuẩn lạc mọc rời nhau ra. Đậy nắp đĩa. Đốt que cấy dưới ngọn lửa đèn cồn trước khi cắm vào giá.
- Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo vô trùng. Thực hiện cấy chuyền nhiều lần để tách ròng các dòng vi khuẩn. Khi thấy các khuẩn lạc rời rạc và đồng nhất về đặc điểm hình thái là dấu hiệu nhận biết vi khuẩn đã ròng và đem quan sát dưới kính hiển vi. - Các dòng vi khuẩn đã ròng được trữ trong glycerol ở -20oC (500µl vi
Hình 8. Một số dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm.
(1): que trải bằng thủy tinh; (2): que cấy móc; (3): que cấy vòng; (4): que cấy thẳng; (5): cân điện tử; (6): tủ cấy vô trùng; (7): nồi khử trùng
(*Nguồn:http://www.dhsphue.edu.vn/dhsphue/view/index.php?opt=fronviewdetail&iddonvi=33&id new=975, ngày 30/07/2013)
Hình 9. Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
(1): khử trùng đầu que cấy; (2): đường cấy zic zắc trên bề mặt thạch dinh dưỡng; (3): kết quả khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch
(*Nguồn:http://www.dhsphue.edu.vn/dhsphue/view/index.php?opt=fronviewdetail&iddonvi=33&id new=975, ngày 30/07/2013)
b. Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc
Sau khi cấy chuyền vi khuẩn trên môi trường đặc và nhận được các dòng vi khuẩn đã ròng, ta tiến hành đo kích thước khuẩn lạc. Đồng thời ghi nhận các chỉ tiêu về hình thái khuẩn lạc bao gồm màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Phương thức quan sát và mô tả hình thái dựa trên Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
c. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Tiến hành quan sát các dòng vi khuẩn đã ròng bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách tiến hành quan sát cũng dựa trên Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
- Nhỏ khoảng 5µl nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào giọt nước trên kính.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o, từ từ hạ kính đậy vật xuống sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần.
d. Nhuộm Gram vi khuẩn
Các bước tiến hành nhuộm kép như sau: - Nhỏ 10µl nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Khử trùng que cấy dưới ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên kính. - Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn.
- Nhỏ 1 - 2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô.
- Nhỏ 1 - 2 giọt Iod lên kính, để yên 1 phút.
- Rửa tiếp mẫu bằng cồn 70o đến khi mất hết màu tím. - Rửa mẫu lại lần nữa bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô. - Nhỏ 1 - 2 giọt Fushin lên kính, để yên 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi thấy hết màu Fushin. - Dùng giấy thấm nhẹ cho khô nước hoặc hơ dưới ngọn lửa đèn cồn. - Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
§ Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh Þ đó là vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet.
§ Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ Þ đó là vi khuẩn Gram âm do không ăn màu Crystal violet nên có màu hồng của Fushin.
3.4.3. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan
Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã tách ròng bằng cách ria cấy lên môi trường NBRIP đặc. Môi trường này chứa lân khó tan có bổ sung chất chỉ thị màu Bromothymol Blue, làm môi trường chuyển sang màu xanh đối với môi trường bazơ và màu vàng đối với môi trường acid.
Những dòng vi khuẩn có thể tồn tại trên môi trường NBRIP được xem là những vi khuẩn hòa tan lân (PSB) và được tiếp tục kiểm tra chỉ số hòa tan lân PSI bằng phương pháp nhỏ giọt trên môi trường NBRIP đặc. Cách tiến hành như sau:
- Chuẩn bị vi khuẩn gốc: dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng (khi lấy mẫu cần lấy đầy loop của que cấy để đảm bảo lượng vi khuẩn được chủng vào môi trường lỏng tương đối đều nhau), ủ ở 27 – 30oC trên máy lắc (350 vòng/phút).
- Sử dụng phương pháp nhỏ giọt để kiểm tra khả năng hòa tan lân trên môi trường NBRIP đặc: chia đĩa môi trường thành 4 phần bằng nhau, chủng vào mỗi phần 4µl vi khuẩn đã nuôi trong môi trường lỏng, để những giọt dung dịch khô sau đó đem ủ 27 – 30oC. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
- Sau khi ủ 2 – 7 ngày, những vi khuẩn có khả năng hòa tan lân sẽ được nhận diện bởi chúng hình thành vùng sáng là vòng tròn trong suốt xung quanh khuẩn lạc (vòng halo).
- Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng do vi khuẩn tạo thành để tính chỉ số hòa tan lân PSI dựa trên công thức (Edi-Premono et al., 1996):
Trong đó:
d (khuẩn lạc): đường kính của khuẩn lạc vi khuẩn.
D (vòng sáng): đường kính của vòng sáng quanh khuẩn lạc.
3.4.4. Khảo sát khả năng hòa tan các nguồn lân khác nhau của các dòng vi khuẩn phân lập đượctrong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn phân lập đượctrong điều kiện phòng thí nghiệm
Tiếp tục khảo sát khả năng hòa tan các nguồn lân khác nhau của các dòng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp phospho-molybdate blue (Murphy và Riley, 1962). Tiến hành thí nghiệm với 2 nguồn lân là: Ca3(PO4)2 và apatite (Ca5(PO4)3OH). Hàm lượng lân hòa tan sẽ được xác định bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880nm.
Ø Chuẩn bị mẫu:
- Chuẩn bị vi khuẩn gốc: nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng trên máy ủ lắc (350 vòng/phút) trong 2 ngày.
- Chủng 1ml vi khuẩn gốc vào các ống falcon có chứa 30ml môi trường NBRIP lỏng chứa một nguồn lân chính, ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc, sau đó tiến hành đo lượng lân hòa tan ở các ngày 5, 10, 15 và 20 ngày sau khi chủng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Ø Chuẩn bị hóa chất: (Cao Ngọc Điệp, 2011)
- Dung dịch A:
(1): 12g (NH4)6MoO24.4H2O (Amoniummolybdate) + 250ml H2O. (2): 0,2908g KsbOC4H2O6 (Potassium antymonyl tartrate) + 100ml H2O.
d (khuẩn lạc) + D (vòng sáng) PSI =
(3): thêm từ từ 140ml H2SO4 đậm đặc vào 1 lít H2O.
(4): cho (1) và (2) vào (3) sau đó thêm nước vào cho đủ 2 lít.
- Dung dịch B: cân 1,05g acid ascorbic cho vào 200ml dung dịch A.
Ø Dựng đường chuẩn lân:
- Chuẩn bị dung dịch P2O5 dùng làm dung dịch lân chuẩn. Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và hàm lượng P2O5 thì cần thiết lập phương trình tương quan giữa 2 chỉ số đó bằng dãy nồng độ P2O5 10mg/l.
- Thực hiện phản ứng màu molybdate ở các nồng độ P2O5 như sau:
§ Chuẩn bị 6 ống nghiệm 20ml, đánh dấu theo thứ tự 0-1-2-3-4-5; cho