a. Phân lập vi khuẩn
- Đối với mẫu đất vùng rễ, sau khi để lắng 30 phút, phần dịch trong ở phía trên sẽ được lấy để tiến hành phân lập vi khuẩn. Đối với mẫu dây khoai lang: Sau khi xử lý mẫu, dùng cối, chày (đã khử trùng nhiệt ướt) nghiền nhỏ mẫu để vi khuẩn thoát ra ngoài, thêm 2 – 5ml nước cất đã khử trùng vào, khuấy đều và ép mạnh, để lắng khoảng 2 phút và thu lấy dịch mẫu. Các bước tiếp theo làm tương tự cho mẫu dây khoai lang và mẫu đất.
- Hút lấy phần dịch mẫu cho vào eppendorf và tiến hành pha loãng mẫu đến 10-1, 10-2, 10-3 lần.
- Hút 30µl dịch mẫu ở các mức pha loãng cho vào môi trường NBRIP đặc và trải mẫu. Ủ mẫu ở 28 - 30oC.
- Quan sát mẫu hàng ngày và tiến hành cấy chuyền nhiều lần để tách ròng các dòng vi khuẩn.
- Khi thấy vi khuẩn đã ròng thì cấy trữ trên môi trường đặc tương ứng. Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi và nhuộm Gram.
Cách phân lập vi khuẩn:
ØTrải dịch nghiền mẫulên môi trường đặc trong đĩapetri (trải mẫu):
- Dùng micropipet vô trùng nhỏ 30µl dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên bề mặt của môi trường trong đĩa petri.
- Dùng que trải thủy tinh dàn đều giọt dịch mẫu trên toàn bộ bề mặt môi trường trong đĩa (hơ que thủy tinh dưới ngọn lửa đèn cồn trước mỗi lần trải mẫu).
- Đậy nắp đĩa petri, úp ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 48 - 72h.
Ø Phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng:
- Sau khi xuất hiện những khuẩn lạc rời trên đĩa petri, dùng que cấy đã khử trùng chấm nhẹ vào một khuẩn lạc để cấy chuyền sang đĩa petri mới chứa sẵn môi trường. Dựa vào đặc điểm khác nhau của các khuẩn lạc mọc trên đĩa khi quan sát bằng mắt thường để cấy chuyền nhằm được các dòng vi khuẩn khác nhau.
- Hé mở nắp đĩa petri, chấm nhẹ que cấy để loại bớt tế bào. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch theo đường zích zắc hay các đường thẳng song song. Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường zích zắc sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các khuẩn lạc mọc rời nhau ra. Đậy nắp đĩa. Đốt que cấy dưới ngọn lửa đèn cồn trước khi cắm vào giá.
- Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo vô trùng. Thực hiện cấy chuyền nhiều lần để tách ròng các dòng vi khuẩn. Khi thấy các khuẩn lạc rời rạc và đồng nhất về đặc điểm hình thái là dấu hiệu nhận biết vi khuẩn đã ròng và đem quan sát dưới kính hiển vi. - Các dòng vi khuẩn đã ròng được trữ trong glycerol ở -20oC (500µl vi
Hình 8. Một số dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm.
(1): que trải bằng thủy tinh; (2): que cấy móc; (3): que cấy vòng; (4): que cấy thẳng; (5): cân điện tử; (6): tủ cấy vô trùng; (7): nồi khử trùng
(*Nguồn:http://www.dhsphue.edu.vn/dhsphue/view/index.php?opt=fronviewdetail&iddonvi=33&id new=975, ngày 30/07/2013)
Hình 9. Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
(1): khử trùng đầu que cấy; (2): đường cấy zic zắc trên bề mặt thạch dinh dưỡng; (3): kết quả khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch
(*Nguồn:http://www.dhsphue.edu.vn/dhsphue/view/index.php?opt=fronviewdetail&iddonvi=33&id new=975, ngày 30/07/2013)
b. Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc
Sau khi cấy chuyền vi khuẩn trên môi trường đặc và nhận được các dòng vi khuẩn đã ròng, ta tiến hành đo kích thước khuẩn lạc. Đồng thời ghi nhận các chỉ tiêu về hình thái khuẩn lạc bao gồm màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Phương thức quan sát và mô tả hình thái dựa trên Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
c. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Tiến hành quan sát các dòng vi khuẩn đã ròng bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách tiến hành quan sát cũng dựa trên Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
- Nhỏ khoảng 5µl nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào giọt nước trên kính.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o, từ từ hạ kính đậy vật xuống sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần.
d. Nhuộm Gram vi khuẩn
Các bước tiến hành nhuộm kép như sau:
- Nhỏ 10µl nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Khử trùng que cấy dưới ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên kính. - Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn.
- Nhỏ 1 - 2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô.
- Nhỏ 1 - 2 giọt Iod lên kính, để yên 1 phút.
- Rửa tiếp mẫu bằng cồn 70o đến khi mất hết màu tím. - Rửa mẫu lại lần nữa bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô. - Nhỏ 1 - 2 giọt Fushin lên kính, để yên 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi thấy hết màu Fushin. - Dùng giấy thấm nhẹ cho khô nước hoặc hơ dưới ngọn lửa đèn cồn. - Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
§ Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh Þ đó là vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet.
§ Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ Þ đó là vi khuẩn Gram âm do không ăn màu Crystal violet nên có màu hồng của Fushin.
