2.4.1. Qui trình xét nghiệm
Mẫu bệnh phẩm được lấy trong môi trường tự nhiên, do nó chứa nhiều loại vi khuẩn khác nhau nên mẫu bệnh phẩm phải được tiến hành phân lập để tách lấy Coliform hoặc E. coli phục vụ cho thí nghiệm.
Bước 1: Các mẫu bệnh phẩm trong tự nhiên được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp cho việc phát triển của E.coli nhưng lại không thích hợp cho các loại vi sinh vật khác. Sau nhiều lần phân lập để tách lấy E.coli ta sẽ có nguồn E.coli mẫu.
Bước 2: Tiến hành chia lượng E.coli phân lập được thành nhiều mẫu đồng
đều nhau.
Bước 3: Lấy một mẫu tiến hành pha loãng và nuôi cấy trên thạch để hình thành khuẩn lạc, xác định lượng E.coli trước chiếu xạ.
Bước 4: Lấy các mẫu còn lại đem chiếu xạ với các cường độ chiếu xạ khác nhau và thời gian chiếu xạ khác nhau. Sau đó đem đi pha loãng và tiến hành nuôi cấy trên thạch để hình thành khuẩn lạc.
Bước 5: Đếm các khuẩn lạc tương ứng với các mẫu chiếu với các cường độ
Hình 2. 14: Mô tả phương pháp pha loãng thập phân.
(a) (b) (c)
Hình 2. 15: Mô tả qui trình đếm vi khuẩn trên mẫu: (a) môi trường MC (Mac Conkey agar) tạo khuẩn lạc màu đỏ hay hồng sáng, (b) môi trường BGA (Brillant
Green Agar) có màu vàng xung quanh khuẩn lạc và (c) môi trường Indol tạo khuẩn lạc màu đỏ3 01H[12].
Hình 2. 16. Phương pháp đếm khuẩn lạc xác định số lượng vi khuẩn E.coli 302H[12]. Ria tia Ria 4 gốc Ria liên tục Ria chữ T Mẫu gốc 1ml 9ml nước cất Độ pha loãng 101 102 103 104 9ml nước cất 9ml nước cất 9ml nước cất 1ml 1ml 1ml
2.4.2. Khảo sát các tính chất và môi trường
Độ hấp thụ tia tử ngoại của các môi trường khác nhau
Với những môi trường nước khác nhau thì hiệu quả diệt khuẩn khác nhau,
đó là do với mỗi môi trường nước khác nhau sẽ có độ hấp thụ tia tử ngoại khác nhau. Với những môi trường có độ hấp thụ tử ngoại lớn thì hiệu quả diệt khuẩn thấp và với những môi trường có độ hấp thụ tử ngoại thấp thì hiệu quả diệt khuẩn sẽ cao hơn.
Quan hệ giữa độ hấp thụ và môi trường nước được thể hiện qua công thức sau: ) 1 ( 100 ad e P = − − [2.8] Trong đó: P: Tỷ lệ phần trăm năng lượng khử trùng bị hấp thụ; a : hệ số hấp thụ; d: Độ sâu của tầng hấp thụ.
Sau đây là bảng quan hệ giữa độ sâu và phần trăm năng lượng tia cực tím bị
hấp thụ của một số môi trường nước. Bảng được trình bày bởi Luckiesh's trong tác phẩm“Applications of Germicidal, Erythemal, and Infrared Energy”. Môi trường nước ở đây coi nhưđồng nhất.
Bảng 2. 2: Phần trăm năng lượng khử trùng của tia UV bị hấp thụ với những độ
Mức độ hấp thụ của tia tử ngoại trong môi trường nước phụ thuộc rất nhiều vào độ tạp chất chứa trong nước. Các tạp chất có tác dụng lớn nhất trong việc hấp thụ năng lượng khử trùng là sắt. Giáo sư Luckiesh và trợ lý của ông đã chỉ ra rằng việc bổ sung thêm 1 lượng sắt bằng 1/1.000.000 nước cất gây ra một sự suy giảm của truyền năng lượng khử trùng bằng 66%. Vì vậy, nước để khử trùng bằng tia UV phải được lọc bằng phương pháp vật lý trước khi đi qua buồng bức xạ khử trùng. Một quá trình lọc khép kín gồm chưng cất (loại bỏ vật lý), và cuối cùng khử trùng bằng UV (loại bỏ các vi khuẩn và virus gây hại). Qui trình này
đươc coi là ứng dụng an toàn nhất của UV trong quá trình xử lý nước uống
Cường độ chiếu xạ
Vào nửa cuối thế kỷ 20, các nhà khoa học thuộc công ty Westinghouse Electricsđã tiếp tục nghiên cứu hiệu quả của các tia UV trong khử trùng sử dụng tia UV bước sóng 254 nm và nhận thấy rằng [13]:
. Cường độ cao cho một khoảng thời gian ngắn, hoặc cường độ thấp trong một thời gian dài hơn về cơ bản giống nhau trong diệt khuẩn.
. Với cùng một nguồn chiếu xạ vào một vùng nhất định thì cường độ năng lượng khử trùng trên bề mặt phơi nhiễm tỉ lệ nghịch với khoảng cách từ nguồn
đến bề mặt phơi nhiễm.
Tỉ lệ diệt khuẩn
Qua nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học đã đưa ra công thức toán học thống kê về hiệu quả diệt vi sinh vật của tia cực tím. Tỉ lệ sống sót được định nghĩa bằng tỉ số mật độ vi khuẩn trước khi chiếu xạ và mật độ vi khuẩn sau chiếu xạ: KEt e P P − = 0 [2.9] Trong đó:
P: là mật độ của vi khuẩn sau chiếu xạ P0: là mật độ ban đầu của vi khuẩn
K: là hằng số xác định từ môi trường (độẩm, nhiệt độ, và các thông số
phụ là thông số biến đổi)
E: là hệ số dòng bức xạ của thiết bị sát trùng t : là thời gian phơi nhiễm.
Cần lưu ý rằng đây là một công thức bị chi phối bởi nguồn gốc và khả năng
đề kháng khác nhau của các vi khuẩn đối với tia UV. Với phân tích chi tiết, các số thực nghiệm có thể bổ sung những giá trị cần thiết cho hằng số K, điều này làm tăng tính chính xác của những mối quan hệở trên.
Do khi dùng công thức trên, ta gặp phải một số khó khăn khi xác định các hệ số thực nghiệm. Vì vậy người ta thường xác định tỉ lệ diệt khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy và đếm vùng phát triển của vi khuẩn.
Hình 2. 17. Nuôi cấy vi khuẩn để xác định tỉ lệ diệt khuẩn 304H[14].
Đưa những ống vi khuẩn đã chiếu xạ thực hiện chia theo tỉ lệ 1/10 để có
được 100µl đưa vào thạch để nuôi cấy. Thực hiện nuôi cấy trong 18 giờ và trong
điều kiện 370C. Sau thời gian này tiến hành đếm lượng vùng đốm. Số lượng đốm sẽ tương ứng với số lượng vi khuẩn.
Tỉ lệ diệt khuẩn được định nghĩa là tỉ số của số lượng vi khuẩn chết sau khi chiếu xạ UV chia cho số lượng vi khuẩn trước khi chiếu UV:
100 . 1 (%) 0 − = N N IR [2.10] Trong đó:
N: Số lượng vùng vi khuẩn sau khi chiếu No: Số lượng vùng vi khuẩn trước khi chiếu
Trong một số trường hợp nếu tỉ lệ vi khuẩn trước và sau chiếu xạ chênh lệch nhau qua lớn thì người ta dùng công thức sau:
0 ) log( N N tio SurvivalRa = t [2.11] Trong đó:
Nt: số vùng đốm của mẫu sau khi chiếu xạ
No: số vùng đốm của mẫu trước khi chiếu xạ
2.4.3. Dụng cụ thiết bị và hóa chất
Hình 2. 18: Các dụng cụ bằng thuỷ tinh được sử dụng trong xét nghiệm vi khuẩn.
Hình 2.18: Các loại que cấy được sử dụng với các dụng cụ thủy tinh trong quá trình xét nghiệm.
Que cấy thẳng Que cấy vòng Thanh gạt
ống nghiệm Đĩa petri Đèn cồn
Hình 2. 19: Các loại cân tiểu li đơn vịđến một phần chục ngàn gram. Môi trường là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất đặc hiệu cho từng loại thử nghiệm. Các loại môi trường:
+ Môi trường lỏng
+ Môi trường đặc (thạch)
Môi trường thương phẩm ở dạng khô, sau khi pha chế sẽ phân phối vào các dụng cụ thích hợp nhưống nghiệm, erlen, đĩa petri
Tất cả môi trường trước khi sử dụng phải được hấp khử trùng - Các loại thuốc thử.
2.4.4. An toàn trong xét nghiệm vi sinh
Đểđảm bảo an toàn cho bản thân và cho người khác trong PTN cần tuân thủ
một số quy tắc an toàn sau:
. Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh.
. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm, mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh.
. Mặc áo blouse trong suốt thời gian làm việc.
. Trước khi bắt đầu làm việc cần sát trùng mặt bàn và hai tay bằng bông tẩm cồn hoặc dung dịch chất dịch khuẩn để khô (chú ý chưa đốt đèn cồn khi tay chưa khô và lặp lại việc khử trùng khi hoàn thành công việc)
Nồi hấp khử trùng
. Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm, bình nuôi cấy.
. Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh ra nơi làm việc, dùng bông tẩm chất diệt khuẩn lau kĩ sau đó thực hiện lại thao tác khử trùng bàn làm việc.
. Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn, tắt lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong thao tác. Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn
đèn cồn. Cần có cách bảo vệ tóc trong trường hợp tóc dài.
. Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác pipet không hút bằng miệng.
. Khi làm vỡ dụng cụ thuỷ tinh, cẩn thận mang găng tay thu gọn tất cả
mảnh vỡ cho vào một túi rác riêng.
. Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng
. Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vào bãi rác. Các dụng cụ, bình chứa vi sinh cần
được ngâm vào dung dịch diệt khuẩn trước khi rửa và tái sử dụng.
. Cần gói hoặc dán bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau. . Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vào đường hô hấp.
. Khi đốt que cấy dính sinh khối cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vào không khí.
Chương 3.
THIẾT KẾ THIẾT BỊ KHỬ VI KHUẨN
SỬ DỤNG UVLED
3.1. Thông số kỹ thuật của UVLED SB1100UV-365nm 3.1.1. Tính chất quang 3.1.1. Tính chất quang
Các tham số điện và quang của UVLED ký hiệu SB1100UV có bước sóng phát xạ 365nm do nhà sản xuất cung cấp được liệt kê ở bảng 3.1. Chúng ta thấy rằng điện áp phân cực UVLED từ 3.4 đến 4 Vdc và dòng cho phép qua từ 350mA
đến 700mA.
Bảng 3. 1: Tham số quang và điện của UVLED SB1100UV-365 305H[15].
Thông số Giá trị Đơn vị
Công suất chiếu xạ 200 mWatt
Bước sóng đỉnh 365 nm
Độ rộng của dải bước sóng 10 nm Áp AK ứng với dòng phân cực thuận 350mA 3.4 Volt Áp AK ứng với dòng phân cực thuận 700mA 4.0 Volt
Lưu ý: Công suất chiếu xạ 200mWatt ứng với dòng phân cực thuận là 700mA và sai số là +/-10%.
3.1.2. Các thông số cực đại khi hoạt động
Bảng 3. 2: Các tham số nhiệt độ của UVLED khi hoạt động ứng với dòng cực
đại cho phép 306H[15].
Thông số Giá trị Đơn vị
Dòng phân cực thuận lớn nhất 1000 mA Dòng phân cực thuận lớn nhất với chếđộ xung 1000 mA Nhiệt độ hoạt động -25~85 0C Nhiệt độ cất giữ -30~100 0C Nhiệt độ mối nối 125 0C Nhiệt độ mối hàn 280 0C Lớp độ nhạy ESD Lớp 2
3.1.3. Các biểu đồ thuộc tính của UVLED
Cũng căn cứ vào tham số kỹ thuật nhà sản xuất, một sốđặc tuyến kỹ thuật của UVLED này được biết đến:
(a) (b)
Hình 3. 1: Dòng UVLED phụ thuộc vào (a) đặc tuyến quan hệ giữa công suất chiếu xạ và (b) độ lệch bước sóng trung tâm 307H[15].
Từ đặc tuyến, ta nhận thấy rằng nếu ta thay đổi dòng điện qua UVLED thì ta sẽ thay đổi được công suất bức xạ của UVLED. Bước sóng bức xạ cũng bị lệch khi dòng tăng.
Quan sát đồ thị cho thấy có thểđiều khiển áp trên AK của UVLED đểđiều khiển dòng qua LED. Nhưng ta thế giá trị thay đổi của áp AK chỉ trong khoảng từ 3,4V đến 4,4V. Trong khi dòng điện qua LED thay đổi từ 50mA đến 700mA. Như vậy việc điều khiển áp AK sẽ khó khăn.
Hình 3. 3: Quanhệ giữa cường độ bức xạ và góc phát của UVLED.
Với góc phát là 00 thì cường độ bức xạđạt 100%, như thếở trung tâm của vòng tròn quầng sáng khi chiếu vào mặt phẳng cường độ bức xạ là 100% và giảm về gần 0% khi góc phát nhỏ hơn 700. Điều này rất quan trọng trong việc bố trí LED cho hợp lý để khi xét cường độ chiếu xạ trên bề mặt phơi nhiễm thì cường
độ chiếu xạ gần như bằng nhau.
3.2. Phương pháp điều khiển công suất chiếu xạ
3.2.1. Điều khiển dòng bằng thay đổi áp trên UAK
U1 LM317 3 1 2 VIN A D J VOUT R2 4K2 D2 UVLED J1 Nguon 1 2 R3 2K R1 2K4 D1 UVLED Vout=[3.4--4.4]V ) ( 3 1 ) ( 25 . 1 2 3 1 2 I R R R R R V Vout + Adj + + + = [3.1]
Hình 3. 5: Sơđồ mạch điều khiển điện áp UAK của UVLED bằng LM317.
Một sốđặc điểm khi dùng phương pháp điều khiển:
. Việc điều khiển áp thực hiện bằng điều chỉnh biến trở do đó áp đặt vào UVLED độ chính xác không cao.
. LM317 cho phép dòng điện qua tối đa là 1.5A do đó lượng UVLED mắc vào tối đa là 2 UVLED. Do vậy với mạch nhiều UVLED phải dùng nhiều IC LM317.
. Việc giao tiếp điều khiển tựđộng bằng vi điều khiển là rất phức tạp.
. Do dòng điện qua UVLED và LM317 liên tục do vậy việc giải nhiệt cho UVLED và IC LM317 là rất quang trọng.
. Quan hệ giữa dòng điện và điện áp qua UVLED là không tuyến tính do đó thay đổi điện áp thì công suất thay đổi không tuyến tính theo điện áp
3.2.2. Điều khiển dòng bằng thay đổi độ rộng xung (PWM) Vcc Vcc MCU PWM UVLED P60N06 R (a) (b)
Hình 3. 6: Mạch điện công suất cho UVLED: (a) dùng PWM điều khiển công suất của UVLED và (b) các dạng xung của tín hiệu V, I và thời gian kích xung.
CC off on on tb I T T T I + = [3.2] Khi điều khiển dòng qua UVLED dưới dạng xung thì điện áp trên 2 đầu của UVLED cũng có dạnng xung, do tính chất của UVLED không có tính cảm kháng cũng như dung kháng nên dòng qua UVLED cũng có dạng giống như dạng điện áp. Như vậy, khi ta thay đổi độ rộng xung áp thì độ rộng xung dòng điện cũng thay đổi theo, vì vậy ta có thể thay đổi dòng điện trung bình qua UVLED bằng cách thay đổi độ rộng xung áp. Một số đặc điểm nổi bật khi dùng phương pháp
điều khiển công suất bằng điều chế PWM:
. Phần cứng kết nối đơn giản làm hệ thống gọn nhẹ, giảm chi phí
. Các vi điều khiển hiện tại hầu hết có tích hợp PWM nên rất thuận tiện cho việc lập trình điều khiển tựđộng
. Do LED và Transistor làm việc ở chế độ xung nên giảm các ảnh hưởng của nhiệt độ, vấn đề giải nhiệt cũng ít quan trọng.
. Độ phân giải điều khiển có thểđạt (1/1000) Pmax nếu dùng PWM 10bit. . Do đóng, cắt bằng xung nên cho phép dòng tức thì qua LED cao hơn rất nhiều lần khi làm việc liên tục, cường độ tức thì cũng cao, tăng hiệu qua đâm xuyên xâm nhập môi trường.
3.3. Bố trí UVLED cho bức xạ cực đại
3.3.1. Thực nghiêm với LED ánh sáng trắng
(a) (b) (c)
(d) (e) (f) (g)
Hình 3. 7: Các mạch bố trí hình dạng các LED khác nhau sẽ cho độ rọi khác nhau: (a) hình vuông lớn, (b) hình thoi nhỏ và dầy, (c) hình thoi nhỏ và thưa, (d)
hình Ovan nhỏ, (e) theo hình Ovan lớn, (f) hình tròn và (g) hình chữ nhật lớn- nhỏ lồng nhau.
Hình 3.8 cho thấy độ rọi của các bố trí LED ánh sáng trắng thay đổi theo hình dạng và khoảng cách bố trí LED. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Đ R i (L u x ) Kho ng Cách (Cm) Quan H Gi a Kho ng Cách và Đ R i Ovan Nh OvanL n ThoiNh ThoiL n VuôngNh VuôngL n Tròn ChNh tNh ChNh tL n
0 5 10 15 20 25 30 0 5.19 10.3 15.26 19.98 24.44 28.6 32.47 36.03 39.29 42.27 Đ R i Góc Phát (đ ) Quan H Gi a Đ R i và Góc Phát