2.5.1. Nguồn gốc
Trà nấm thủy sâm (Tên nước ngoài Kombucha hoặc Kargasok).
Đây là loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi loại nấm người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm trường sinh). Thời xưa, người vùng Kargasok thuộc Nga dùng trà nấm này có tác dụng giúp sống khỏe và kéo dài tuổi xuân nên nó có tên gọi là trà nấm Kargasok. Những người hưởng thọ ở Nga bảo là sống lâu như vậy không những ở môi trường, tập quán sinh hoạt và tâm hồn thư thả mà từ hàng trăm năm nay họ còn có thói quen dùng trà lên men này. Loại trà này chứa
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
một lượng cao chất đạm mà cơ thể con người có thể hấp thụ vào cơ quan một cách nhanh chóng. Nấm trà kích thích những siêu vi khuẩn phân hóa thành các chất dinh dưỡng hữu ích cho con người đào thải những độc tố trong cơ thể ra ngoài bằng đường bài tiết.
Khi một nữ du khách quý tộc Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng, trông thấy những người già cả ở đây khỏe mạnh lạ thường, gương mặt họ không có nếp nhăn và không lộ vẻ già nua. Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi nguồn gốc thì được biết dân chúng ở đây có thói quen uống trà Kombucha hàng ngày. Bà xin một ít nấm về để làm giống, đem về Nhật và sau đó chia cho bạn bè để cùng nhau sử dụng. Sau nhiều tháng, các bạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này. Do đó, trà nấm được đồn đại và truyền đi khắp Nhật Bản và được gọi tên là trà Kombucha. (Nguồn: http://namthuysam.com/, ngày 29/07/2013).
2.5.2. Giá trị dinh dƣỡng
Thành phần trà Kombucha có chứa enzyme tiêu hóa, vitamin và nhiều hợp chất hữu cơ. Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% ethanol, acid acetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid carbonic, acid caprilic, acid citric, acid oxalic, acid usnic, acid folic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, acid amin, một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc. Trà Kombucha còn chứa một lượng nhỏ caffeine vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha (Nguồn: http://namthuysam.com/, ngày 29/07/20113).
Hình 11. Sản phẩm thủy sâm trên thị trƣờng
(*Nguồn: http://www.thanhnien.com.vn/pages/20110918/thuy-sam-chua-ba- benh.aspx, ngày 9/11/2013).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 3. Thành phần chất khô của thủy sâm
Thành phần
g/kg chất khô
Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
Chất khô (%) Protein thô Sợi thô Lipid thô Tro Nitơ tự do Thành phần acid Thành phần trung tính Hemicellulose Carbon Oxy Natri Kali Phospho Canxi Clo Magie Sắt Mangan Kẽm Lưu huỳnh 96,39 ± 1,04 121,50 ± 1,15 63,30 ± 0,85 18,10 ± 0,56 8,50 ± 0,51 78,80 ± 0,65 329,0 ± 1,23 389,0 ± 1,52 60,0 ± 0,65 42,86 ± 0,50 43,85 ± 0,72 0,28 ± 0,01 0,20 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,37 ± 0,01 0,05 ± 0,00 0,07 ± 0,00 0,68 ± 0,00 0,11 ± 0,01 97,38 ± 0,91 184,10 ± 1,63 124,50 ± 1,22 47,10 ± 0,49 29,20 ± 0,66 61,60 ± 0,58 404,70 ± 1,52 471,20 ± 1,04 66,50 ± 0,85 g/100g chất thô 45,40 ± 0,84 46,40 ± 1,00 0,30 ± 0,01 0,17 ± 0,02 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,40 ± 0,00 0,05 ± 0,00 0,07 ± 0,00 0,09 ± 0,06 0,12 ± 0,04 97,35 ± 0,87 231,10 ± 0,98 147,90 ± 0,65 54,30 ± 0,61 39,70 ± 1,21 52,70 ± 08,4 463,30 ± 1,52 531,30 ± 1,55 68,00 ± 0,74 28,13 ± 0,56 49,49 ± 0,85 0,33 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,04 ± 0,00 0,45 ± 0,00 0,06 ± 0,00 0,08 ± 0,00 0,09 ± 0,03 0,12 ± 0,02
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 4. Thành phần acid amin của thủy sâm
Acid amin
mg/g chất khô
Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
Acid amin thiết yếu
Isoleucine Leucine lysine Methionin Phenylalanine Threonine Valine Tryptophan
Acid amin không thiết yếu
Alanine Arginine Acid aspartide Cysteine Acid glutamide Glycine Histidine Proline Serine Tyrosine 28,1 ± 0,51 27,2 ± 0,75 39,5 ± 0,50 6,3 ± 0,55 13,6 ± 0,55 7,7 ± 0,20 15,1 ± 0,26 7,4 ± 0,26 30,9 ± 0,55 14,5 ± 0,60 30,3 ± 0,70 10,3 ± 0,70 32,2 ± 0,61 9,5 ± 0,55 6,0 ± 0,30 28,5 ± 0,45 11,2 ± 0,36 9,9 ± 0,45 35,2 ± 0,04 35,9 ± 0,64 48,0 ± 0,36 11,3 ± 0,80 22,3 ± 0,70 13,2 ± 0,58 22,3 ± 0,45 12,3 ± 0,51 41,9 ± 0,40 30,8 ± 0,60 42,0 ± 0,65 15,2 ± 0,35 42,3 ± 0,50 17,2 ± 0,30 10,6 ± 0,55 35,2 ± 0,60 22,2 ± 0,51 18,6 ± 0,40 44,2 ± 0,36 45,1 ± 0,60 53,1 ± 0,40 20,2 ± 0,50 30,2 ± 0,60 20,1 ± 0,65 30,2 ± 0,61 21,1 ± 0,45 53,0 ± 0,50 42,2 ± 0,60 53,2 ± 0,60 24,4 ± 0,47 50,1 ± 0,47 26,6 ± 0,81 18,5 ± 0,60 43,4 ± 0,55 31,7 ± 0,61 27,0 ± 0,55
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.5.3. Công dụng
Thủy sâm (Kombucha) là dịch trà lên men với nguồn giống là sự kết hợp giữa vi khuẩn acid acetic và nấm men (Aidoo et al., 2006). Nhiều nghiên cứu cho thấy thủy sâm có tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người như làm giảm chứng viêm khớp (Dufresne và Farnworth, 2000), táo bón, khó tiêu và cao huyết áp (Erst, 2003).
Theo dược sĩ Lê Kim Phụng, trà Kombucha mang lại các lợi ích sau:
- Tăng sức chịu đựng dẻo dai bền bỉ cho cơ thể, được xem như một loại thuốc bổ, làm giảm đau cơ và triệu chứng mệt mỏi.
- Vì là men tiêu hóa, trà Kombucha giúp gia tăng lượng vi khuẩn Bifidium sp. có lợi trong ruột, nhờ sản sinh acid lactic. Vi khuẩn này tác động giống như vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus thường có trong các loại sữa chua lên men (yoghurt). Trà Kombucha sản sinh hai loại acid lactic và acid acetic giúp tăng nhanh quá trình lên men trong ruột. Trà Kombucha giúp ngừa táo bón, nhiễm trùng đường ruột, kiết lị, rối loạn tiêu hóa, chữa viêm loét ruột và dạ dày.
- Cải thiện làn da, trà Kombucha tăng tính đàn hồi cho da, làm màu da tươi sáng hơn. Trà Kombucha còn có tác dụng chữa bệnh vảy nến, chàm, mụn nước, mụt cóc, viêm da, sừng da và giúp mọc tóc nhiều hơn.
- Giải độc cơ thể, nhờ acid glycuronic kết hợp với các độc tố trong gan và làm chúng dễ tan trong nước, sau đó bài tiết qua đường tiểu.
- Chữa đau khớp, sản phẩm chuyển hóa của acid glycuronic là glucosamine rất tốt cho hệ keo giúp bôi trơn các khớp xương và sụn, nhất là ở những người lớn tuổi hay bị đau khớp.
- Tác dụng kháng sinh, trà Kombucha còn sản sinh acid usnic, có thể chống lại các vi khuẩn gây bệnh như Streptococci, Diplococci, và Shigella; giúp cân bằng hệ acid base cho cơ thể khi chúng ta ăn uống không đúng cách.
- Chống trầm cảm và chữa chứng thiếu ngủ.
- Giúp gia tăng thị lực, chữa bệnh quáng gà, chảy nước mắt và chứng đục thủy tinh thể ở người cao tuổi. Trà Kombucha còn giải cơn ghiền rượu cho những người có thói quen uống rượu (Nguồn: http://tuoitre.vn/chinh-tri-xa-hoi/song-khoe/416138/tra-kombucha-va-suc- khoe.htmL, 31/07/2013).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
2.5.4. Quy trình lên men thủy sâm
Môi trường lên men được chuẩn bị như sau:
Chuẩn bị 5 g trà đen bổ sung 700 mL nước, đun sôi 15 phút. Sau đó lọc, bổ sung 100 g đường, bổ sung thêm nước cho đủ 1000mL, khử trùng 121ºC trong 15 phút (theo Yang et al., 2010).
Hình 12. Quy trình sản xuất thủy sâm
(*Nguồn: Haizhen et al., 2007)
Nước Trà Đun sôi Loại bỏ xác trà Để nguội Chủng giống Lên men Thủy sâm thành phẩm Đường glucose, saccharose
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013.
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị
- Buồng cấy vô trùng (Microflow, Anh)
- Nồi hấp tiệt trùng (Salm en kipp bv, 22793 Breukelen, Hà Lan) - Cân phân tích (OHAUS Corp, ARA520, Mỹ)
- Kính hiển vi quang học (OLYMPUS OPTICAL, BH-2, Nhật) - Tủ ủ (Ehret, Đức)
- Buồng đếm hồng cầu - Tủ lạnh
- Máy đo pH TitroLine (Schott) - Máy vortex (Heipolph, Đức)
- Một số dụng cụ khác của phòng thí nghiệm: Brix kế, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác, giá ống nghiệm, pipet, …
3.2.2. Nguyên vật liệu
- Mẫu thủy sâm từ các hộ gia đình ở các địa điểm khác nhau (Hậu Giang, Bến Tre, Cờ Đỏ, Bình Thủy, Trà Nóc).
- Đường saccharose mua ở siêu thị Coopmark Cần Thơ. - Trà lipton mua ở siêu thị Coopmark Cần Thơ.
3.2.3. Hóa chất
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 5. Thành phần cho 1000 mL môi trƣờng YPGD
STT Hóa chất Khối lƣợng (g)
1 D-glucose 5
2 Yeast extraction 5
3 Glycerol 5
4 Polypeptone 5
Hóa chất: Acid acetic, Ethanol, CaCO3, NaOH, Phenolphtalein, Bromothymol blue, cồn 96º, cồn 70º, agar,…
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Các phương pháp phân tích lý hóa
- pH: Giá trị pH sẽ được đo trực tiếp bằng pH kế.
- Acid tổng số: Xác định acid tổng số bằng phương pháp chuẩn độ. - Độ Brix: Xác định độ Brix bằng Brix kế.
3.2.3. Xử lý số liệu, phân tích thống kê
Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mền Minitab 16.
Kết quả ghi nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010.
3.4. Nội dung và bố trí thí nghiệm
3.4.1. Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm sâm sâm
Phân lập vi khuẩn acid acetic a. Mục đích
Phân lập các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm.
b. Phương pháp thực hiện
Môi trường YPGD bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol, cho vào mỗi ống nghiệm pha loãng 9 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,85%) khử trùng 121ºC trong 15 phút.
Lắc đều mẫu thủy sâm, pha loãng mẫu nồng độ 10-1 đến 10-7.
Hút 200 L mẫu pha loãng ở các nồng độ thích hợp cấy trãi lên môi trường YPGD bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Quan sát chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường.
Cấy ria nhiều lần khuẩn lạc trên môi trường YPGD bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol cho đến khi đạt dòng thuần.
Định danh sơ bộ vi khuẩn acid acetic a. Mục đích
Định danh các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm.
b. Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị môi trường YPGD loãng bổ sung NaOH 0,1N đến khi môi trường đạt pH 7.
Pha dung dịch Bromothymol blue với công thức 0,1 g Bromothymol blue, cho vào 16 mL NaOH 0,1N, thêm nước vừa đủ 250 mL.
Lấy một lượng vừa đủ khuẩn lạc các dòng đã thuần cho vào môi trường.
Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Bromothymol blue đã pha (môi trường chuyển sang màu xanh).
Ủ ở 30ºC trong 24 giờ quan sát (tất cả đều chuyển từ màu xanh lam sang vàng).
Tiếp tục ủ ở 30ºC trong 48-72 giờ (cứ 24 giờ quan sát một lần). Môi trường vẫn màu vàng vi khuẩn thuộc giống Gluconobacter.
Môi trường chuyển sang màu xanh vi khuẩn thuộc giống Acetobacter.
3.4.2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh
a. Mục đích
Xác định các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh nhằm ứng dụng cho lên men thủy sâm
b. Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị môi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol khử trùng 121ºC, 15 phút.
Cấy ria các dòng đã thuần lên môi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol.
Ủ ở 30ºC trong 48-72 giờ, quan sát.
Xác định đường kính vòng halo quanh khuẩn lạc (tỉ lệ đường kính vòng halo trên đường kính khuẩn lạc càng lớn thì khả năng sinh acid acetic càng mạnh).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Xử lý thống kê bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Minitab 16.
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men a. Mục đích a. Mục đích
Xác định mật số giống chủng thích hợp cho quá trình lên men.
b. Phương pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố và 3 lần lăp lại.
Nhân tố mật số giống chủng có 3 mức độ: 103, 105 và 107. Tổng số nghiệm thức là: 3x3=9.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Chuẩn bị 150-200 mL môi trường YPGD cho vào bình tam giác 500 mL, khử trùng 121ºC trong 15 phút, để nguội. Dùng que cấy lấy một lượng vi khuẩn vừa đủ cho vào bình, nuôi tăng sinh trong 24-48 giờ.
Pha loãng mẫu: các nồng độ 10-1, 10-2, …, 10-7 .
Lấy mỗi nồng độ 1 mL mẫu đem đếm, tính mật số vi khuẩn, chủng 1 mL vi khuẩn (chọn nồng độ chứa mật số vi khuẩn thích hợp) vào dung dịch nước trà đường đã chuẩn bị với nồng độ trà 1% và đường 21%.
Chủng giống nấm men có khả năng sinh ethanol tốt được phân lập từ thủy sâm với mật số 105 tế bào/mL (Nguyễn Vân Sơn, 2013).
Lên men ở nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC) trong 7 ngày. Xác định hàm lượng acid tổng sinh ra trong từng ngày.
Đánh giá cảm quan sản phẩm sau lên men.
3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và pH đến quá trình lên men
a. Mục đích
Xác định nồng độ đường và pH thích hợp cho quá trình lên men.
b. Phương pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm với 2 nhân tố và 3 lần lăp lại.
Nhân tố đường có 5 mức độ: 10, 15, 20, 25 và 30%.
Nhân tố pH của môi trường có 4 mức độ: 4, 5, 6 và pH tự nhiên của môi trường trà.
Tổng số nghiệm thức là: 5x4x3=60.
Chuẩn bị mẫu: cho 60 g trà vào 5 L nước đun sôi khoảng 15 phút cho đường saccharose vào dung dịch trà, bổ sung nước đủ 6 L.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Điều chỉnh nồng độ đường bằng cách cho đường vào dịch trà và kiểm tra bằng Brix kế đến khi đạt các giá trị 10, 15, 20, 25 và 30ºBrix.
Hiệu chỉnh pH của dịch trà đạt các giá trị 4, 5, 6 và pH tự nhiên của môi trường trà (bổ sung NaHSO3 0,1N và acid acetic).
Khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, để nguội.
Chủng giống vi khuẩn acid acetic đã tuyển chọn và giống nấm men có khả năng sinh ethanol cao với mật số 105
tế bào/mL vào dung dịch trà đường. Lên men ở nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC) trong 7 ngày Xác định hàm lượng acid tổng sinh ra trong từng ngày
Đánh giá cảm quan sản phẩm sau lên men.
3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men
a. Mục đích
Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men.
b. Phương pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm với 2 nhân tố và 3 lần lăp lại.
Nhân tố nhiệt độ môi trường có 4 mức độ: nhiệt độ phòng mát (25ºC), 30ºC và nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC).
Nhân tố thời gian lên men có 3 mức độ: 5, 7 và 9 ngày. Tổng số nghiệm thức là: 3x3x3=27.
Chuẩn bị dung dịch trà đường: cho 30 g trà vào 2,5 mL nước đun sôi 15 phút, bổ sung lượng đường thích hợp đã thực hiện ở thí nghiệm trên, thêm nước đủ 3 L, khử trùng, để nguội.
Chủng giống vi khuẩn acid acetic với mật số thích hợp đã thực hiên ở thí nghiệm trên và chủng nấm men có khả năng sinh ethanol cao đã chọn với mật số