Môi trường lên men được chuẩn bị như sau:
Chuẩn bị 5 g trà đen bổ sung 700 mL nước, đun sôi 15 phút. Sau đó lọc, bổ sung 100 g đường, bổ sung thêm nước cho đủ 1000mL, khử trùng 121ºC trong 15 phút (theo Yang et al., 2010).
Hình 12. Quy trình sản xuất thủy sâm
(*Nguồn: Haizhen et al., 2007)
Nước Trà Đun sôi Loại bỏ xác trà Để nguội Chủng giống Lên men Thủy sâm thành phẩm Đường glucose, saccharose
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013.
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị
- Buồng cấy vô trùng (Microflow, Anh)
- Nồi hấp tiệt trùng (Salm en kipp bv, 22793 Breukelen, Hà Lan) - Cân phân tích (OHAUS Corp, ARA520, Mỹ)
- Kính hiển vi quang học (OLYMPUS OPTICAL, BH-2, Nhật) - Tủ ủ (Ehret, Đức)
- Buồng đếm hồng cầu - Tủ lạnh
- Máy đo pH TitroLine (Schott) - Máy vortex (Heipolph, Đức)
- Một số dụng cụ khác của phòng thí nghiệm: Brix kế, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác, giá ống nghiệm, pipet, …
3.2.2. Nguyên vật liệu
- Mẫu thủy sâm từ các hộ gia đình ở các địa điểm khác nhau (Hậu Giang, Bến Tre, Cờ Đỏ, Bình Thủy, Trà Nóc).
- Đường saccharose mua ở siêu thị Coopmark Cần Thơ. - Trà lipton mua ở siêu thị Coopmark Cần Thơ.
3.2.3. Hóa chất
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 5. Thành phần cho 1000 mL môi trƣờng YPGD
STT Hóa chất Khối lƣợng (g)
1 D-glucose 5
2 Yeast extraction 5
3 Glycerol 5
4 Polypeptone 5
Hóa chất: Acid acetic, Ethanol, CaCO3, NaOH, Phenolphtalein, Bromothymol blue, cồn 96º, cồn 70º, agar,…
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Các phương pháp phân tích lý hóa
- pH: Giá trị pH sẽ được đo trực tiếp bằng pH kế.
- Acid tổng số: Xác định acid tổng số bằng phương pháp chuẩn độ. - Độ Brix: Xác định độ Brix bằng Brix kế.
3.2.3. Xử lý số liệu, phân tích thống kê
Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mền Minitab 16.
Kết quả ghi nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010.
3.4. Nội dung và bố trí thí nghiệm
3.4.1. Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm sâm sâm
Phân lập vi khuẩn acid acetic a. Mục đích
Phân lập các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm.
b. Phương pháp thực hiện
Môi trường YPGD bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol, cho vào mỗi ống nghiệm pha loãng 9 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,85%) khử trùng 121ºC trong 15 phút.
Lắc đều mẫu thủy sâm, pha loãng mẫu nồng độ 10-1 đến 10-7.
Hút 200 L mẫu pha loãng ở các nồng độ thích hợp cấy trãi lên môi trường YPGD bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Quan sát chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường.
Cấy ria nhiều lần khuẩn lạc trên môi trường YPGD bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol cho đến khi đạt dòng thuần.
Định danh sơ bộ vi khuẩn acid acetic a. Mục đích
Định danh các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm.
b. Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị môi trường YPGD loãng bổ sung NaOH 0,1N đến khi môi trường đạt pH 7.
Pha dung dịch Bromothymol blue với công thức 0,1 g Bromothymol blue, cho vào 16 mL NaOH 0,1N, thêm nước vừa đủ 250 mL.
Lấy một lượng vừa đủ khuẩn lạc các dòng đã thuần cho vào môi trường.
Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Bromothymol blue đã pha (môi trường chuyển sang màu xanh).
Ủ ở 30ºC trong 24 giờ quan sát (tất cả đều chuyển từ màu xanh lam sang vàng).
Tiếp tục ủ ở 30ºC trong 48-72 giờ (cứ 24 giờ quan sát một lần). Môi trường vẫn màu vàng vi khuẩn thuộc giống Gluconobacter.
Môi trường chuyển sang màu xanh vi khuẩn thuộc giống Acetobacter.
3.4.2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh
a. Mục đích
Xác định các dòng vi khuẩn sinh acid acetic mạnh nhằm ứng dụng cho lên men thủy sâm
b. Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị môi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol khử trùng 121ºC, 15 phút.
Cấy ria các dòng đã thuần lên môi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol.
Ủ ở 30ºC trong 48-72 giờ, quan sát.
Xác định đường kính vòng halo quanh khuẩn lạc (tỉ lệ đường kính vòng halo trên đường kính khuẩn lạc càng lớn thì khả năng sinh acid acetic càng mạnh).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Xử lý thống kê bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Minitab 16.
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men a. Mục đích a. Mục đích
Xác định mật số giống chủng thích hợp cho quá trình lên men.
b. Phương pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố và 3 lần lăp lại.
Nhân tố mật số giống chủng có 3 mức độ: 103, 105 và 107. Tổng số nghiệm thức là: 3x3=9.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Chuẩn bị 150-200 mL môi trường YPGD cho vào bình tam giác 500 mL, khử trùng 121ºC trong 15 phút, để nguội. Dùng que cấy lấy một lượng vi khuẩn vừa đủ cho vào bình, nuôi tăng sinh trong 24-48 giờ.
Pha loãng mẫu: các nồng độ 10-1, 10-2, …, 10-7 .
Lấy mỗi nồng độ 1 mL mẫu đem đếm, tính mật số vi khuẩn, chủng 1 mL vi khuẩn (chọn nồng độ chứa mật số vi khuẩn thích hợp) vào dung dịch nước trà đường đã chuẩn bị với nồng độ trà 1% và đường 21%.
Chủng giống nấm men có khả năng sinh ethanol tốt được phân lập từ thủy sâm với mật số 105 tế bào/mL (Nguyễn Vân Sơn, 2013).
Lên men ở nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC) trong 7 ngày. Xác định hàm lượng acid tổng sinh ra trong từng ngày.
Đánh giá cảm quan sản phẩm sau lên men.
3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và pH đến quá trình lên men
a. Mục đích
Xác định nồng độ đường và pH thích hợp cho quá trình lên men.
b. Phương pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm với 2 nhân tố và 3 lần lăp lại.
Nhân tố đường có 5 mức độ: 10, 15, 20, 25 và 30%.
Nhân tố pH của môi trường có 4 mức độ: 4, 5, 6 và pH tự nhiên của môi trường trà.
Tổng số nghiệm thức là: 5x4x3=60.
Chuẩn bị mẫu: cho 60 g trà vào 5 L nước đun sôi khoảng 15 phút cho đường saccharose vào dung dịch trà, bổ sung nước đủ 6 L.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Điều chỉnh nồng độ đường bằng cách cho đường vào dịch trà và kiểm tra bằng Brix kế đến khi đạt các giá trị 10, 15, 20, 25 và 30ºBrix.
Hiệu chỉnh pH của dịch trà đạt các giá trị 4, 5, 6 và pH tự nhiên của môi trường trà (bổ sung NaHSO3 0,1N và acid acetic).
Khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, để nguội.
Chủng giống vi khuẩn acid acetic đã tuyển chọn và giống nấm men có khả năng sinh ethanol cao với mật số 105
tế bào/mL vào dung dịch trà đường. Lên men ở nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC) trong 7 ngày Xác định hàm lượng acid tổng sinh ra trong từng ngày
Đánh giá cảm quan sản phẩm sau lên men.
3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men
a. Mục đích
Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men.
b. Phương pháp thực hiện
Bố trí thí nghiệm với 2 nhân tố và 3 lần lăp lại.
Nhân tố nhiệt độ môi trường có 4 mức độ: nhiệt độ phòng mát (25ºC), 30ºC và nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32ºC).
Nhân tố thời gian lên men có 3 mức độ: 5, 7 và 9 ngày. Tổng số nghiệm thức là: 3x3x3=27.
Chuẩn bị dung dịch trà đường: cho 30 g trà vào 2,5 mL nước đun sôi 15 phút, bổ sung lượng đường thích hợp đã thực hiện ở thí nghiệm trên, thêm nước đủ 3 L, khử trùng, để nguội.
Chủng giống vi khuẩn acid acetic với mật số thích hợp đã thực hiên ở thí nghiệm trên và chủng nấm men có khả năng sinh ethanol cao đã chọn với mật số 105 tế bào/mL.
Lên men ở các nhiệt độ 25ºC, 30ºC và nhiệt độ môi trường xung quanh (28- 32)ºC. Mỗi nhiệt độ lên men ở 3 khoảng thời gian: 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày.
Xác định hàm lượng acid tổng sinh ra trong từng ngày. Đánh giá cảm quan sản phẩm sau lên men.
3.4.6. Thử nghiệm quy trình sản xuất thủy sâm a. Mục đích a. Mục đích a. Mục đích
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Thử nghiệm lên men thủy sâm từ dòng vi khuẩn phân lập với các điều kiện tuyển chọn từ thí nghiệm trên.
b. Phương pháp thực hiện
- Quy trình sản xuất thủy sâm:
- Cách thực hiện:
Cho cho 1 L nước vào 15 g trà, đun sôi 15 phút.
Lọc, cho vào dung dịch trà lượng đường đã chọn, bổ sung nước cho đủ 1,5 L, khử trùng 121ºC trong 15 phút, để nguội.
Chủng giống vi khuẩn ở nồng độ đã chọn ở thí nghiệm trên.
Chủng giống nấm men có khả năng sinh ethanol cao với mật số 105 tế bào/mL. Lên men ở nhiệt độ và thời gian đã chọn ở thí nghiệm trên.
Thủy sâm thành phẩm.
Xác định các chỉ tiêu về độ Brix, pH, hàm lượng acid sinh ra, đánh giá cảm quan sản phẩm sau lên men.
Nước Trà Đun sôi Loại bỏ xác trà Để nguội Chủng giống Lên men Thủy sâm thành phẩm Đường glucose, saccharose
Hình 13. Quy trình sản xuất thủy sâm
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ-THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm
Phân lập các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm
Qua quá trình phân lập và tách ròng các dòng vi khuẩn từ 5 mẫu thủy sâm thu thập được ở các địa điểm: Hậu Giang, Bến Tre, Cờ Đỏ, Bình Thủy, Trà Nóc thu được 33 dòng vi khuẩn AAB thể hiện ở Bảng 6.
Bảng 6. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YPGD
STT Dòng AAB Nguồn gốc 1 BT 1 Bến Tre 2 BT 2.1 Bến Tre 3 BT 2.2 Bến Tre 4 BT 3.1 Bến Tre 5 BT 3.3.2 Bến Tre 6 BT 4.1 Bến Tre 7 BT 4.2 Bến Tre 8 BT 4.3.1 Bến Tre 9 BT 4.3.2 Bến Tre 10 BTh 1.1 Bình Thủy 11 BTh 1.2 Bình Thủy 12 BTh 2.2 Bình Thủy 13 CD 1.1 Cờ Đỏ 14 CD 1.2 Cờ Đỏ 15 CD 1.2.1 Cờ Đỏ 16 CD 1.3 Cờ Đỏ 17 CD 1.3.1 Cờ Đỏ 18 CD 1.4 Cờ Đỏ 19 CD 2.1 Cờ Đỏ 20 CD 2.2 Cờ Đỏ 21 CD 3.1.1 Cờ Đỏ 22 CD 3.1.2 Cờ Đỏ 23 CD 3.2 Cờ Đỏ 24 HG 1 Hậu Giang 25 HG 1.1 Hậu Giang
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học 26 HG 3.1 Hậu Giang 27 HG 3.2 Hậu Giang 28 HG 3.3.1 Hậu Giang 29 HG 3.3.2 Hậu Giang 30 TN 1.1 Trà Nóc 31 TN 1.2 Trà Nóc 32 TN 2 Trà Nóc 33 TN 3 Trà Nóc
Tất cả các dòng vi khuẩn AAB phân lập được trên môi trường YPGD đều cho khuẩn lạc tròn đều, bìa nguyên, một số dòng có bìa răng cưa các khuẩn lạc tạo vùng sáng trên môi trường YPGD có bổ sung ethanol và CaCO3 chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sử dụng ethanol để tạo ra acid acetic và lượng acid sinh ra có khả năng phân hủy CaCO3 tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc.
Vùng sáng khuẩn lạc
tạo thành
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Các dòng vi khuẩn AAB phân lập được đều có dạng hình cầu, một số có dạng hình elip (dòng TN 1.1, BT 3.1). Dạng cầu gồm cầu đơn, cầu đôi, hoặc kết thành chuỗi khác nhau về kích thước.
Vi khuẩn acid acetic là vi khuẩn Gram âm, kết quả nhuộm Gram cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều bắt màu đỏ của Fuchsin.
Đặc điểm các dòng vi khuẩn AAB phân lập được trên môi trường YPGD có bổ sung ethanol và CaCO3, ủ ở 30ºC sau 72 giờ được thể hiện ở Bảng 7.
HG3.1
Hình 16. Tế bào bắt màu đỏ khi nhuộm Gram
TN 1.2
Hình 15. Hình dạng tế bào vi khuẩn AAB trên kính hiển vi với độ phóng đại X100
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 7: Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn AAB ủ ở 30ºC sau 72 giờ
STT Dòng
AAB
Màu sắc Hình dạng Bìa Độ nổi Kích thƣớc
(mm)
1 BT 1 Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô cao 1,0
2 BT 2.1 Trắng ngã
vàng
Tròn đều Nguyên Mô 2,2
3 BT 2.2 Vàng nhạt Tròn đều Nguyên Mô cao 1,7
4 BT 3.1 Trắng ngà Tròn đều Nguyên Lài 1,9
5 BT 3.3.2 Vàng đậm Tròn đều Nguyên Mô 2,4
6 BT 4.1 Vàng Tròn đều Nguyên Lài 2,3
7 BT 4.2 Vàng đậm Tròn đều Nguyên Mô cao 2,0
8 BT 4.3.1 Vàng đậm Tròn đều Nguyên Hơi mô 1,6
9 BT 4.3.2 Vàng nhạt Tròn đều Nguyên Mô 1,8
10 BTh 1.1 Trắng đục Tròn đều Răng cưa Lài 2,6
11 BTh 1.2 Vàng đậm Tròn đều,
trơn bóng
Nguyên Mô 1,8
12 BTh 2.2 Trắng đục Tròn đều Nguyên Hơi mô 1,7
13 CD 1.1 Vàng nhạt Tròn đều Nguyên Mô 1,3
14 CD 1.2 Vàng đậm Tròn đều,
trơn bóng
Nguyên Mô 1,8
15 CD 1.2.1 Vàng nhạt Tròn đều,
trơn bóng Nguyên Mô 1,5
16 CD 1.3 Vàng đậm Tròn đều Nguyên Mô cao 1,4
17 CD 1.3.1 Vàng Tròn đều Nguyên Hơi mô 1,9
18 CD 1.4 Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,3
19 CD 2.1 Vàng nhạt Tròn đều Nguyên Mô cao 2,1
20 CD 2.2 Vàng nhạt Tròn đều Nguyên Mô 2,0
21 CD 3.1.1 Trắng ngà Tròn đều Nguyên Mô 1,8
22 CD 3.1.2 Vàng đậm Tròn đều Nguyên Hơi mô 2,2
23 CD 3.2 Trắng ngà Tròn đều Nguyên Lài 1,3
24 HG 1 Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2,3
25 HG 1.1 Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,7
26 HG 3.1 Trắng đục Tròn đều,
trơn bóng
Nguyên Mô 1,5
27 HG 3.2 Trắng đục Tròn đều Nguyên Lài 2,5
28 HG 3.3.1 Vàng Tròn đều Nguyên Mô 1,5
29 HG 3.3.2 Vàng nhạt Tròn đều Nguyên Hơi mô 1,9
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
31 TN 1.2 Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1,1
32 TN 2 Trắng ngà Tròn đều Nguyên Hơi mô 1,7
33 TN 3 Vàng Tròn đều Nguyên Mô 1,5
Kết quả ở Bảng 7 cho thấy vi khuẩn acid acetic đa dạng vể màu sắc, hình dạng cũng như kích thước khuẩn lạc. Tuy nhiên các dòng vi khuẩn phân lập được chủ yếu có màu trắng đục đến vàng nhạt, bìa nguyên, tròn đều, kích thước khuẩn lạc khoảng 1,5-2,4 mm. Một số dạng khuẩn lạc phân lập được thể hiện trong Hình 17.
Hình 17. Một số dạng khuẩn lạc của dòng vi khuẩn AAB
CD 1.3.1
BT 2.2 TN 1.2
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn acid acetic lên men thủy sâm
Định danh vi khuẩn AAB thuộc 2 giống Acetobacter và Gluconobacter bằng phản ứng oxy hóa acetate. Nuôi vi khuẩn AAB trong môi trường dinh dưỡng (YPGD) có bổ sung dung dịch thử Bromothymol blue, ban đầu môi trường có màu xanh lam của dung dịch Bromothymol blue. Ủ ở 30ºC trong 24 giờ tất cả các ống đều chuyển