3. Nội dung nghiên cứu
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN
Để xác định trình tự nucleotide của gen defensin1 đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tự trên thiết bị giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen defensin1 của giống ngô TQ1, CB2 với gen defensin1 ngô có mã số JF797205 và HG792392 trên ngân hàng gen NCBI đƣợc trình bày ở hình 3.6 và bảng 3.4, 3.5.
Kết quả cho thấy kích thƣớc gen defensin1 ở giống ngô TQ1, CB2 có kích thƣớc là 243bp. Nhƣ vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách dòng và giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen defensin1 của giống địa phƣơng TQ1, CB2. So sánh trình tự nucleotide của cho thấy các trình tự này khác nhau ở vị trí 43, 69, 195, 212.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. So sánh trình tự nucleotide của gen defensin1
ở TQ1, CB2 với JF797205, HG792392
Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen defensin1 của 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI Vị trí Mẫu 43 69 195 212 JF797205 A G T C CB2 C A C C TQ1 C G C T HG792392 A G C C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Trình tự gen defensin1 của 2 giống ngô TQ1, CB2 và 2 trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI có hệ số tƣơng đồng cao (98,7 – 99,5%). Kết quả thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng nucleotide của gen defensin1 ở 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI Vị trí Mẫu JF797205 CB2 TQ1 HG792392 JF797205 100 98,7 98,7 99,5 CB2 100 99,1 99,1 TQ1 100 99,1 HG792392 100
Việc nghiên cứu gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này, chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen defensin1 của giống ngô TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 trên ngân hàng gen, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.7 và bảng 3.6, 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
của giống TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 trên NCBI
Kết quả trên cho thấy, trình tự amino acid suy diễn trong protein defensin1 ở giống TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 có độ dài 80 amino acid. Tuy nhiên các trình tự này có sự khác nhau ở một vài vị trí, cụ thể:
- CB2 khác biệt so với JF797205 và HG792392 ở vị trí 15 (L → M), khác TQ1 ở vị trí 71 (T → M).
- TQ1 khác JF797205 và HG792392 ở vị trí 15 (L → M) và 71 (M → T).
Bảng 3.6. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein defensin1 ở 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI
Vị trí Mẫu 15 71 JF797205 M (Methionine) T (Threonine) CB2 L (Leucine) T (Threonine) TQ1 L (Leucine) M (Methionine) HG792392 M (Methionine) T (Threonine)
Hệ số tƣơng đồng của các giống về trình tự amino acid suy diễn là 97,5 – 100%. Từ kết quả thu nhận đƣợc có thể nhận thấy 2 giống có khả năng kháng mọt khác nhau có sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn. Trong khi vị trí số 71 của CB2 (kháng mọt kém) là threonine, một amino acid phân cực và ƣa nƣớc thì ở TQ1 (kháng mọt tốt) lại là methionine thuộc nhóm amino acid không phân cực và kị nƣớc.
Bảng 3.7. Hệ số tƣơng đồng amino acid suy diễn của protein defensin1 ở 2 giống ngô TQ1, CB2 với JF797205, HG792392 trên NCBI
Vị trí
Mẫu JF797205 CB2 TQ1 HG792392
JF797205 100 98,7 97,5 100
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TQ1 100 97,5
HG792392 100
Sự sai khác về trình tự nucleotide và amino acid suy diễn ở trên là cơ sở để chúng tôi có những nghiên cứu tiếp theo với nhiều giống ngô địa phƣơng hơn nữa và so sánh giữa hai nhóm kháng mọt tốt và kém nhằm tìm kiếm tính quy luật của sự thay đổi vị trí các nucleotide và amino acid liên quan đến tính kháng mọt của các giống ngô. Đây chính là tiền đề cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống ngô có khả năng kháng mọt tốt, năng suất cao, phục vụ sản xuất và đời sống.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Khả năng kháng mọt của các giống ngô có sự khác nhau, giống TQ1 là giống kháng mọt tốt nhất, giống CB2 là giống kháng mọt kém nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2. Khuếch đại, chọn dòng thành công và xác định trình tự nucleotide của gen
defensin1 của hai giống ngô TQ1 và CB2 đều dài 243bp.
3. Trình tự nucleotide của gen defensin1 ở 2 giống TQ1, CB2 có hệ số tƣơng đồng cao 98,7 – 99,5% so với trình tự có mã số JF797205, HG792392 trên ngân hàng gen NCBI.
4. Sự khác biệt về trình tự amino acid suy diễn trong protein defensin1 của 2 giống ngô TQ1, CB2 so với JF797205, HG792392 nằm ở vị trí 15, 71 với hệ số tƣơng đồng về trình tự amino acid suy diễn là 97,5 – 100%.
Đề nghị
1. Cần tiếp tục xác định trình tự gen defensin1 của một số giống ngô địa phƣơng có khả năng kháng mọt tốt và kém khác nhau để xác định chính xác chỉ thị phân tử liên quan để khả năng kháng mọt bằng gen defensin1.
2. Thiết kế vector mang gen defensin1 nhằm tạo cây ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trần Văn Chƣơng (2000), Khảo sát hiện trạng chất lượng ngô 4 huyện vùng núi cao phía Bắc tỉnh Hà Giang và một số biện pháp thích hợp giảm tổn thất sau
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ thu hoạch, Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học, Sở Khoa học và Công nghệ Hà Giang.
2. Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng năng suất, NXB Lao động - Xã hội.
3. Đƣờng Hồng Dật (2006), Sâu bệnh hại ngô, cây lương thực trồng cạn và biện pháp phòng trừ, NXB Lao động - Xã hội.
4. Lê Doãn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật của công nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp.
5. Trƣơng Văn Đích (2005), Kĩ thuật trồng ngô năng suất cao, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
6. Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
7. Nguyễn Kim Hoa, Nguyễn Văn Liêm, Trần Thị Hƣờng, Nguyễn Thị Hiền (2008), "Đặc điểm sinh học chủ yếu của mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch. (Col.: Curculionidae) và mọt bột sừng Gnathocerus cornutus Fabr (Col.:
Tenebrionidae)", Hội nghị Côn trùng học lần thứ 6, tr:560–569.
8. Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình Kiểm dịch thực vật và dịch hại nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp.
9. Lê Đình Lƣơng, Lê Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp.
10. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, NXB Nông nghiệp.
11. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội. 12. Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần côn trùng
hại kho ở Việt Nam năm 1996 - 2000, một số ứng dụng bảo vệ thực vật vào sản xuất nông nghiệp, NXB Nông nghiệp.
13. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA, tập II, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
14. Ngô Hữu Tình (2003), Cây ngô, NXB Nghệ An.
15. Nguyễn Thị Giáng Vân (1996), Thành phần côn trùng kho ở Việt Nam, Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học, Cục Bảo vệ thực vật.
16. Nguyễn Kim Vũ (2000), Báo cáo tổng kết khoa học công nghệ đề tài KH 08-12, Bộ Khoa học và Công nghệ.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17. Allen A., Snyder A.K., Preuss M., Nielsen E.E., Shah D.M., Smith T.J. (2008), "Plant defensins and virally encoded fungal toxin KP4 inhibit plant root growth", Planta, 227(2), pp:331–339.
18. Almeida M.S., Cabral K.M., Kurtenback E., Almeida F.C., Valente A.P. (2002), "Solution structure of Pisum sativum defensin 1 by high resolution NMR: plant defensin, identical backbone with different mechanism of action", Mol Bio, 315, pp:749–757.
19. Bloch Jr C., Richardson M. (1991), "A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect α-amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat γ-purothionins", FEBS Lett, 279(1), pp:101–104.
20. Carvalho A. de O., Gomes V.M. (2011), "Plant defensins and defensin-like peptides - biological activities and biotechnological applications", Curr Pharm Des, 17(38), pp:4270–4293.
21. Chang M.T. (2005), "Corn Breeding Achievement in United States", Report in 9th Asian Regional Maize Workshop.
22. Chen K.C., Lin C.Y., Kuan C.C., Sung H.Y., Chen C.S. (2002), "A novel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid", J Agric Food Chem, 50(25), pp:7258–7263.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
23. Colilla F.J., Rocher A., Mendez E. (1990), "γ-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm", FEBS Lett, 270(1–2), pp:191–194.
24. Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A., Wu Y., Woerner B.M., Stark D.M., Shah D.M., Liang J., Rommens C.M. (2000), "Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide", Nat Biotechnol, 18(12), pp:1307–1310.
25. Elfstrand M., Fossdal C.G., Swedjemark G., Clapham D., Olsson O., Sitbon F., Sharma P., Lönneborg A., Arnold S. von (2001), "Identification of candidate genes for use in molecular breeding - A case study with the Norway spruce defensin-like gene, spi1", Silvae Genet, (50), pp:75–81.
26. Gu Q., Kawata E.E., Morse M.J., Wu H.M., Cheung A.Y. (1992), "A flower- specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco", Mol Gen Genet MGG, 234(1), pp:89–96.
27. Harrison S.J., Marcus J.P., Goulter K.C., Green J.L., Maclean D.J., Manners J.M. (1997), "An antimicrobial peptide from the Australian native Hardenbergia violacea provides the first functionally characterised member of a subfamily of plant defensins", Funct Plant Biol, 24(5), pp:571–578.
28. Jha S., Tank H.G., Prasad B.D., Chattoo B.B. (2009), "Expression of Dm-AMP1 in rice confers resistance to Magnaporthe oryzae and Rhizoctonia solani",
Transgenic Res, 18(1), pp:59–69.
29. Kanzaki H., Nirasawa S., Saitoh H., Ito M., Nishihara M., Terauchi R., Nakumura I. (2002), "Overexpression of the wasabi defensin gene confers enhanced resistance to blast fungus (Magnaporthe grisea) in transgenic rice",
TAG Theor Appl Genet Theor Angew Genet, 105(6-7), pp:809–814.
30. Koike M., Okamoto T., Tsuda S., Imai R. (2002), "A novel plant defensin-like gene of winter wheat is specifically induced during cold acclimation", Biochem Biophys Res Commun, 298(1), pp:46–53.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
31. Lai F.M., DeLong C., Mei K., Wignes T., Fobert P.R. (2002), "Analysis of the DRR230 family of pea defensins: gene expression pattern and evidence of broad host-range antifungal activity", Plant Sci, 163(4), pp:855–864.
32. Lay F., Anderson M. (2005), "Defensins - Components of the Innate Immune System in Plants", Curr Protein Pept Sci, 6(1), pp:85–101.
33. Liu Y.J., Cheng C.S., Lai S.M., Hsu M.P., Chen C.S., Lyu P.C. (2006), "Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids", Proteins, 63(4), pp:777–786. 34. Melo F.R., Rigden D.J., Franco O.L., Mello L.V., Ary M.B., Grossi de Sá M.F.,
Bloch C. Jr. (2002), "Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling, and docking", Proteins, 48(2), pp:311–319.
35. Mendez E., Moreno A., Colilla F., Pelaez F., Limas G.G., Mendez R., Soriano F., Salinas M. (1990), "Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, γ-hordothionin, from barley endosperm", Eur J Biochem, 194(2), pp:533–539.
36. Mendez E., Rocher A., Calero M., Girbés T., Citores L., Soriano F. (1996), "Primary structure of omega-hordothionin, a member of a novel family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems", Eur J Biochem FEBS, 239(1), pp:67–73.
37. Moreno M., Segura A., García-Olmedo F. (1994), "Pseudothionin-St1, a potato peptide active against potato pathogens", Eur J Biochem FEBS, 223(1), pp:135– 139.
38. Osborn R.W., De Samblanx G.W., Thevissen K., Goderis I., Torrekens S., Van Leuven F., Attenborough S., Rees S.B., Broekaert W.F. (1995), "Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae", FEBS Lett, 368(2), pp:257–262.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
39. Park H.C., Kang Y.H., Chun H.J., Koo J.C., Cheong Y.H., Kim C.Y., Kim M.C., Chung W.S., Kim J.C., Yoo J.H. (2002), "Characterization of a stamen- specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage", Plant Mol Biol, 50(1), pp:59–69.
40. Pelegrini P.B., Lay F.T., Murad A.M., Anderson M.A., Franco O.L. (2008), "Novel insights on the mechanism of action of alpha-amylase inhibitors from the plant defensin family", Proteins, 73(3), pp:719–729.
41. Sambrook J., Russel D.W (2001), Molecular cloning, A laboratory manual, Vol. 2, Third edition, CSHL Press, pp:8.1-8.24.
42. Snelson J.T. (1987), Grain protectants, ACIAR Monographs Series 3, Australian Centre for International Agricultural Research.
43. Stiekema W.J., Heidekamp F., Dirkse W.G., Beckum J. van, Haan P. de, Bosch C. ten, Louwerse J.D. (1988), "Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs", Plant Mol Biol, 11(3), pp:255–269.
44. Stotz H.U., Thomson J.G., Wang Y. (2009), "Plant defensins: defense, development and application", Plant Signal Behav, 4(11), pp:1010–1012.
45. Stotz H.U., Spence B., Wang Y. (2009), "A defensin from tomato with dual function in defense and development", Plant Mol Biol, 71(1-2), pp:131–143. 46. Tavares L.S., Santos M. de O., Viccini L.F., Moreira J.S., Miller R.N.G., Franco
O.L. (2008), "Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers", Peptides, 29(10), pp:1842–1851.
47. Terras F.R., Eggermont K., Kovaleva V., Raikhel N.V., Osborn R.W., Kester A., Rees S.B., Torrekens S, Leuven F.V., Vanderleyden J. (1995), "Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense.", Plant Cell Online, 7(5), pp:573–588.
48. Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F., Van Leuven F., Rees S.B., Vanderleyden J., Cammue B.P., Broekaert W.F. (1992), "Analysis of two novel
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds", J Biol Chem, 267(22), pp:15301–15309.
49. Thevissen K., François I.E.J.., Takemoto J.Y., Ferket K.K.., Meert E.M.., Cammue B.P.. (2003), "DmAMP1, an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii), interacts with sphingolipids from Saccharomyces cerevisiae",
FEMS Microbiol Lett, 226(1), pp:169–173.
50. Thomma B., Cammue B., Thevissen K. (2002), "Plant defensins", Planta, 216(2), pp:193–202.
51. Wang B., Yu J., Zhu D., Zhao Q. (2013), "Maize defensin ZmDEF1 is involved in plant response to fungal phytopathogens", Afr J Biotechnol, 10(72), pp:16128–16137.
52. Wang Y., Nowak G., Culley D., Hadwiger L.A., Fristensky B. (1999), "Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease in transgenic canola (Brassica napus)", Mol Plant Microbe Interact, 12(5), pp:410–418.
53. Wijaya R., Neumann G.M., Condron R., Hughes A.B., Polya G.M. (2000), "Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin", Plant Sci Int J Exp Plant Biol, 159(2), pp:243–255.
54. Yount N.Y., Wang M.S., Yuan J., Banaiee N., Ouellette A.J., Selsted M.E. (1995), "Rat neutrophil defensins. Precursor structures and expression during neutrophilic myelopoiesis", J Immunol Baltim Md 1950, 155(9), pp:4476–4484. 55. Zainal Z., Marouf E., Ismail I., Fei C.K. (2009), "Expression of the Capsicuum
annum (chili) defensin gene in transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogens", Am J Plant Physiol, 4(2), pp:70–79.
56. Zhang Y., Lewis K. (1997), "Fabatins: new antimicrobial plant peptides", FEMS Microbiol Lett, 149(1), pp:59–64.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
57. Zhu Y.J., Agbayani R., Moore P.H. (2007), "Ectopic expression of Dahlia merckii defensin DmAMP1 improves papaya resistance to Phytophthora palmivora by reducing pathogen vigor", Planta, 226(1), pp:87–97.
TÀI LIỆU INTERNET
58. http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Maize&oldid=604761244 59. http://faostat.fao.org/ 60. http://igc.int/downloads/gmrsummary/gmrsumme.pdf 61. http://invasive.org/browse/detail.cfm?imgnum=52050 62. https://ncbi.nlm.nih.gov/ 63. http://nmri.org.vn/