3. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA
Có nhiều kỹ thuật tách chiết RNA tổng số khác nhau nhƣng đều nhằm mục đích thu nhận các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi các tác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhân cơ học hoặc không bị đứt gãy. Đó là điều kiện quyết định ảnh hƣởng đến sự thành công hay thất bại của quá trình nghiên cứu.
Ở ngô, gen defensin1 đƣợc biểu hiện mạnh ở giai đoạn hạt non và hạt trƣởng thành, còn các mô khác thì không hoạt động cho dù đã cảm ứng bằng ABA và methyl jasmonate. Sau khi xử lý, hạt ngô đƣợc ngâm ủ cho nảy mầm rồi thu lá sau 5 – 7 ngày tuổi. Lá non của 2 giống ngô TQ1, CB2 có khả năng kháng mọt khác nhau đƣợc sử dụng để tách chiết RNA tổng số.
Trong quá trình tách chiết, mẫu lá đƣợc nghiền một cách nhanh chóng trong nitơ lỏng để phá vỡ thành tế bào, giải phóng các thành phần bên trong. Các thành phần bổ sung nhƣ phenol, chloroform:isoamyl nhanh chóng biến tính protein, polysaccharide và kết tủa chúng, giúp tách pha tốt sau quá trình ly tâm. Sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong nƣớc 0,1 % DEPC có tác dụng ngăn cản quá trình RNase thủy phân RNA.
Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và nồng độ RNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260/280nm. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng RNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ đƣợc thể hiện ở bảng 3.3. Tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 chứng tỏ các mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.3. Phổ hấp thụ RNA ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của 2 mẫu ngô nghiên cứu
STT Mẫu A260 A260/280 Hàm lƣợng (ng/μl)
1 TQ1 12,27 1,96 491 2 CB2 30,95 2,00 1238
RNA đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngƣợc tạo cDNA. Sau khi tổng hợp cDNA theo quy trình đƣợc mô tả ở mục 2.3.2.2, chúng tôi tiến hành đo quang phổ hấp thụ của các mẫu TQ1 và CB2. Kết quả nằm trong khoảng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1,8 – 2,0, chứng tỏ chúng có độ tinh sạch cao và có thể sử dụng để thực hiện phản ứng PCR.