3. Nội dung nghiên cứu
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trình tự DNA đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự DNA tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer tại Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT
3.1.1. Đặc điểm hình thái, khối lượng của các giống ngô nghiên cứu
Hình thái và khối lƣợng hạt là những đặc tính quan trọng trong chọn giống ngô vì nó liên quan đến chất lƣợng và năng suất. Các mẫu ngô địa phƣơng đƣợc thu thập ở các tỉnh miền núi phía Bắc, mẫu đối chứng có nguồn gốc từ Viện nghiên cứu ngô. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng hạt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
STT Giống Hình thái hạt Màu vỏ hạt Khối lƣợng 1000 hạt (g) 1 SL1 Hạt tròn, mẩy Trắng vàng 291,80 ± 1,66 2 SL2 Hạt dẹt, mẩy Trắng ngà 235,39 ± 1,22 3 TQ1 Hạt tròn, nhỏ Trắng đục 201,71 ± 0,94 4 TQ2 Hạt tròn, mẩy Trắng tím 252,84 ± 1,03 5 CB1 Hạt tròn, mẩy Trắng ngà 266,81 ± 1,28 6 CB2 Hạt dẹt, nhỏ Trắng đục 171,41 ± 2,11 7 ĐH Hạt tròn, nhỏ Trắng vàng 189,29 ± 1,91 8 LC Hạt tròn, nhỏ Vàng cam 225,91 ± 1,50 9 LS Hạt nhỏ, mẩy Trắng đục 212,70 ± 1,75 10 NĐ Hạt tròn, mẩy Vàng nhạt 223,48 ± 0,50
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lƣợng 1000 hạt của 10 giống ngô dao động trong khoảng 171,41 ± 2,11 (g) đến 291,80 ± 1,66 (g). Cao nhất là giống SL1, thấp nhất là giống CB2. Thứ tự xếp hạng theo khối lƣợng từ cao xuống thấp cụ thể nhƣ sau:
SL1 > CB1 > TQ2 > SL2 > LC > NĐ > LS > TQ1 > ĐH > CB2
Tính trạng màu sắc và khối lƣợng đều do gen quy định. Tuy nhiên, tính trạng màu sắc ít chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng. Trong khi đó, tính trạng khối lƣợng có thể thay đổi nếu chịu các tác động ngoại cảnh của môi trƣờng vào các giai đoạn phát triển khác nhau của cây.
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt
Mọt thƣờng tấn công vào phôi trƣớc, sau đó đến nội nhũ và các bộ phận khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Thời gian phá hoại của mọt trong chu kỳ sinh trƣởng tƣơng đối dài. Năng suất, chất lƣợng ngô bị ảnh hƣởng nhiều khi bị mọt tấn công. Defensin thực vật ức chế hoạt động của α-amylase trong ruột mọt bằng cách gắn kết với trung tâm hoạt động của enzyme, do đó ức chế quá trình tiêu hóa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tinh bột. Để đánh giá khả năng kháng mọt của các mẫu ngô nghiên cứu, chúng tôi dựa vào việc tính toán lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi (1 – 2 – 3 – 4 tuần) đối với loài mọt ngô Sitophilus zeamais. Mỗi lọ thí nghiệm chứa 50 g ngô hạt và thả vào đó 15 cặp mọt trƣởng thành. Kết quả thu đƣợc số liệu ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 10 giống ngô nghiên cứu (đơn vị: gam)
Giống 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần Trung bình
SL1 0,37 ± 0,04 2,54 ± 0,08 4,86 ± 0,32 7,1 ± 0,25 3,72 SL2 0,48 ± 0,05 1,84 ± 0,07 5,15 ± 0,23 7,22 ± 0,21 3,67 TQ1 0,22 ± 0,04 1,52 ± 0,08 2,77 ± 0,12 5,49 ± 0,23 2,50 TQ2 2,96 ± 0,07 7,27 ± 0,08 14,48 ± 0,44 21,09 ± 0,20 11,45 CB1 0,32 ± 0,05 2,26 ± 0,05 4,74 ± 0,33 6,95 ± 0,25 3,57 CB2 5,42 ± 0,08 14,54 ± 0,34 23,62 ± 0,77 31,16 ± 0,53 18,69 ĐH 3,32 ± 0,05 8,9 ± 0,21 15,69 ± 0,38 22,58 ± 0,42 12,62 LC 1,95 ± 0,06 5,52 ± 0,17 9,51 ± 0,50 14,14 ± 0,56 7,78 LS 2,89 ± 0,06 8,58 ± 0,09 14,72 ± 0,52 21,56 ± 0,66 11,94 NĐ 0,57 ± 0,06 2,62 ± 0,06 5,07 ± 0,15 8,35 ± 0,09 4,15 Trung bình 1,85 5,56 10,06 14,56
Bảng 3.2 cho ta thấy sau 1 - 2 - 3 - 4 tuần, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều bị mọt xâm hại, mức độ thức ăn hao hụt tăng theo thời gian: Sau 1 tuần, lƣợng ngô hao hụt trung bình ở các mẫu nghiên cứu là 1,85 g; sau 2 tuần là 5,56 g; sau 3 tuần là 10,06 g; sau 4 tuần là 14,56 g.
Để kiểm tra xem lƣợng ngô hao hụt ở các mẫu thí nghiệm trên có thực sự khác nhau hay không, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis [11], kết quả tính đƣợc giá trị H
= 18,52 > χ90,05= 16,92. Do đó có thể kết luận: Lƣợng thức ăn hao hụt ở các mẫu thí nghiệm thực sự khác nhau ở mức tin cậy 95%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Lượng thức ăn hao hụt theo thời gian ở các mẫu ngô nghiên cứu
0 5 10 15 20 25 30 35
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
Thời gian K h ố i l ư ợ n g h ao h ụ t (g ) SL1 SL2 TQ1 TQ2 CB1 CB2 ĐH LC LS NĐ
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian ở các mẫu ngô nghiên cứu
Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt do mọt ngô thể hiện mức thiệt hại tăng dần theo thời gian. Lƣợng hao hụt càng cao chứng tỏ khả năng kháng mọt của mẫu ngô kém và ngƣợc lại. Dựa vào số liệu và biểu đồ trên, có thể nhận thấy mẫu ngô TQ1 là giống kháng mọt tốt nhất (lƣợng thức ăn hao hụt trung bình là 2,50 g) và mẫu ngô CB2 là giống kháng mọt kém nhất (lƣợng thức ăn hao hụt trung bình là 18,69 g). Chúng tôi lựa chọn hai mẫu này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DEFENSIN
Với mục tiêu so sánh sự sai khác trong cấu trúc gen defensin1 của giống ngô có khả năng kháng mọt khác nhau, chúng tôi đã sử dụng giống TQ1 (thuộc nhóm kháng mọt tốt nhất) và CB2 (thuộc nhóm kháng mọt kém nhất) để phân lập và giải trình tự gen defensin1.
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA
Có nhiều kỹ thuật tách chiết RNA tổng số khác nhau nhƣng đều nhằm mục đích thu nhận các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi các tác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhân cơ học hoặc không bị đứt gãy. Đó là điều kiện quyết định ảnh hƣởng đến sự thành công hay thất bại của quá trình nghiên cứu.
Ở ngô, gen defensin1 đƣợc biểu hiện mạnh ở giai đoạn hạt non và hạt trƣởng thành, còn các mô khác thì không hoạt động cho dù đã cảm ứng bằng ABA và methyl jasmonate. Sau khi xử lý, hạt ngô đƣợc ngâm ủ cho nảy mầm rồi thu lá sau 5 – 7 ngày tuổi. Lá non của 2 giống ngô TQ1, CB2 có khả năng kháng mọt khác nhau đƣợc sử dụng để tách chiết RNA tổng số.
Trong quá trình tách chiết, mẫu lá đƣợc nghiền một cách nhanh chóng trong nitơ lỏng để phá vỡ thành tế bào, giải phóng các thành phần bên trong. Các thành phần bổ sung nhƣ phenol, chloroform:isoamyl nhanh chóng biến tính protein, polysaccharide và kết tủa chúng, giúp tách pha tốt sau quá trình ly tâm. Sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong nƣớc 0,1 % DEPC có tác dụng ngăn cản quá trình RNase thủy phân RNA.
Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và nồng độ RNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260/280nm. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng RNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ đƣợc thể hiện ở bảng 3.3. Tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 chứng tỏ các mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.3. Phổ hấp thụ RNA ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của 2 mẫu ngô nghiên cứu
STT Mẫu A260 A260/280 Hàm lƣợng (ng/μl)
1 TQ1 12,27 1,96 491 2 CB2 30,95 2,00 1238
RNA đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngƣợc tạo cDNA. Sau khi tổng hợp cDNA theo quy trình đƣợc mô tả ở mục 2.3.2.2, chúng tôi tiến hành đo quang phổ hấp thụ của các mẫu TQ1 và CB2. Kết quả nằm trong khoảng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1,8 – 2,0, chứng tỏ chúng có độ tinh sạch cao và có thể sử dụng để thực hiện phản ứng PCR.
3.2.2. Kết quả nhân gen defensin1
Để tiến hành nhân gen defensin1 của 2 mẫu ngô, một mẫu kháng mọt tốt và một mẫu kháng mọt kém bằng phƣơng pháp PCR, chúng tôi đã dựa vào trình tự gen
defensin1 đƣợc phân lập từ ngô có mã số JF797205 đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI để thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Thành phần phản ứng đƣợc thể hiện ở bảng 2.5.
Trong quá trình thực hiện, chúng tôi đã tính toán nhiệt độ gắn mồi và tiến hành phản ứng PCR với nhiều điều kiện khác nhau. Từ đó nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58oC. Sau 35 chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với DNA Marker 1kb Plus và đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen defensin1
(M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas); 1: TQ1; 2: CB2)
Kết quả nhân gen cho thấy, ở 2 mẫu nghiên cứu xuất hiện băng DNA duy nhất sáng rõ có kích thƣớc khoảng 250bp, theo đúng tính toán khi thiết kế mồi. Kích thƣớc của sản phẩm PCR nhận đƣợc phù hợp với kích thƣớc gen defensin1, chứng tỏ phản ứng PCR thành công.
3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
M 1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thông thƣờng sau khi chạy PCR, ngoài đoạn gen defensin1 còn có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hƣởng đến các kết quả của quá trình tách dòng. Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification (Bioneer). Sản phẩm thu đƣợc thƣờng sạch dNTP thừa và protein.
Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lƣợng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen cho ta thấy một băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng 250bp, chứng tỏ đã thu nhận đƣợc đoạn gen defensin1 mong muốn. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành tiếp phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen defensin1
(M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas); 1: TQ1; 2: CB2)
3.2.4. Kết quả tách dòng gen
Tách dòng gen để nhân dòng gen quan tâm với số lƣợng lớn. Sản phẩm PCR nhân gen defensin1 đƣợc làm sạch bằng kit tinh sạch, sau đó đƣợc gắn vào vector pBT (Viện Công nghệ Sinh học) để tạo vector tái tổ hợp. Trình tự của gen quan tâm sẽ đƣợc nối vào giữa trình tự MCS (multiple cloning site) ở trên trình tự gen mã hóa enzyme β-galactosidase (lacZ) của vector pBT. Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào
M 1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau đó, nuôi vi khuẩn E. coli DH5α đã biến nạp trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG nhƣ mô tả ở mục 2.3.2.6.
Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37o
C, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc trên môi trƣờng chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên vẫn còn khả năng sinh tổng hợp protein β- galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
3.2.5. Kết quả chọn dòng gen
Chọn các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa thạch chuyển sang nuôi trong LB lỏng (có bổ sung carbenicillin). Để kiểm tra các dòng khuẩn lạc trắng có mang gen
defensin1 hay không, chúng tôi tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi M13F và M13R. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony PCR
(M: DNA Marker 1kb Plus (Fermentas); Giếng 1-2: dòng khuẩn lạc của TQ1, 1 2 M 3 4 5
400bp → 250bp →
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Giếng 3-4-5: dòng khuẩn lạc của chủng CB2)
Khi sử dụng mồi M13 để kiểm tra, kích thƣớc của gen quan tâm sẽ tăng 124bp so với PCR với mồi đặc hiệu. Kết quả hình 3.4 cho thấy giếng 1, 2, 3, 5 xuất hiện các vạch ở vị trí khoảng 370bp, phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thƣớc gen quan tâm khi PCR với mồi M13. Có thể kết luận ban đầu rằng các dòng khuẩn lạc tƣơng tứng với giếng 1, 2, 3, 5 đều mang gen quan tâm. Giếng 4 không xuất hiện băng tƣơng ứng có thể là dòng khuẩn lạc này mang plasmid bị đột biến mất đoạn gen lacZ và trình tự bám mồi M13 nhƣng vẫn mang trình tự kháng kháng sinh nên vẫn có thể sống trên môi trƣờng chọn lọc, không phân hủy cơ chất tạo màu, không tạo sản phẩm khi tiến hành colony PCR. Những dòng khuẩn lạc có mang gen
defensin1 đƣợc nuôi trong LB lỏng và tiến hành tách chiết plasmid để phục vụ việc giải trình tự.
3.2.6. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Chọn lọc khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với 2 mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR ở trên để tách plasmid tái tổ hợp theo bộ kit AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer). Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di thể hiện ở hình 3.5.
M 1 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.5. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp.
(M: DNA Marker 1kb (Fermentas); 1: Plasmid mang gen defensin1 của giống TQ1 2: Plasmid mang gen defensin1 của giống CB2)
Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy, sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen defensin1 đạt kết quả tốt, các băng vạch gọn và rõ nét. Theo tính toán lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2705 bp, sản phẩm PCR gen đích 243 bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 2950 bp. Chứng tỏ plasmid tái tổ hợp không bị đứt gãy, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen defensin1.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN DEFENSIN
Để xác định trình tự nucleotide của gen defensin1 đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tự trên thiết bị giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen defensin1 của giống ngô TQ1, CB2 với gen defensin1 ngô có mã số JF797205 và HG792392 trên ngân hàng gen NCBI đƣợc trình bày ở hình 3.6 và bảng 3.4, 3.5.
Kết quả cho thấy kích thƣớc gen defensin1 ở giống ngô TQ1, CB2 có kích thƣớc là 243bp. Nhƣ vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách dòng và giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen defensin1 của giống địa phƣơng TQ1, CB2. So sánh trình tự nucleotide của cho thấy các trình tự này khác nhau ở vị trí 43, 69, 195, 212.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. So sánh trình tự nucleotide của gen defensin1
ở TQ1, CB2 với JF797205, HG792392
Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen defensin1 của 2 giống ngô TQ1, CB2 và các trình tự có mã số JF797205 và HG792392 trên NCBI