3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Defensin thực vật
1.3.1.1. Giới thiệu chung
Defensin là những protein nhỏ giàu cystein đƣợc tìm thấy ở cả động vật có xƣơng sống, động vật không xƣơng sống và thực vật. Về mặt chức năng, chúng có vai trò nhƣ những peptide bảo vệ vật chủ (host defense peptides). Defensin có hoạt tính chống khuẩn, chống nấm và chống nhiều loại virus.
Defensin thực vật là những peptide nhỏ (~5kDa, 45 đến 54 amino acid), độ ổn định cao, có dạng cấu trúc gấp khúc ba chiều trong không gian, gồm khoảng 8 gốc cysteine liên kết với nhau bởi cầu nối disunfide. Defensin thực vật đầu tiên đƣợc phân lập từ lúa mỳ (Triticum aestivum) [23] và lúa mạch (Hordeum vulgare) [35]. Chúng đƣợc gọi với tên “defensin thực vật” bởi chúng có cấu trúc mang nhiều nét tƣơng đồng với defensin ở nhiều loài sinh vật khác, trong đó có con ngƣời. Cho tới nay, đã xác định đƣợc trình tự của hơn 80 loại gen defensin thực vật khác nhau.
Nhóm các defensin thực vật khá đa dạng tƣơng ứng với vị trí khác nhau của các amino acid cũng nhƣ nhóm 8 gốc cystein trong tất cả các loại defensin thực vật [48]. Sự khác biệt trong cấu trúc bậc nhất dẫn tới các hoạt tính sinh học khác nhau đối với các loại defensin này. Cấu trúc không gian của defensin thực vật gồm ba phiến gấp β và một chuỗi xoắn α ở vị trí song song với nhau, đƣợc giữ vững bởi 4 cầu nối disunfide [18]. Cấu trúc này có nhiều điểm tƣơng đồng với defensin của côn trùng và động vật có vú (CSαβ), ngoại trừ điểm khác đó là defensin côn trùng không có vùng tƣơng đƣơng với sợi β đầu amino (amino-terminal β strand) nhƣ ở thực vật.
Defensin1 đƣợc phân lập từ giống ngô NongDa108 gồm có vùng tín hiệu dẫn gồm 31 amino acid, vùng chức năng gồm 49 amino acid. Trong vùng chức năng có chứa 8 phân tử cystein tạo nên 4 cầu disulfide giúp ổn định cấu trúc [51].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 1.2. Hai lớp defensin thực vật [32]
Dựa vào cấu trúc tiền protein có thể chia các defensin thực vật làm 2 lớp chính: Lớp đầu tiên và lớn nhất là các tiền protein có chứa trình tự tín hiệu lƣới nội chất và vùng defensin. Những protein này đƣợc vận chuyển theo con đƣờng tiết và không có nhân tố tín hiệu cụ thể cho quá trình biến đổi sau dịch mã hay hƣớng đích dƣới cấp độ tế bào (hình 1.2A).
Lớp defensin thứ hai đƣợc sản sinh ra từ các tiền protein lớn hơn do có chứa tiền vùng đầu C (C-terminal prodomain) khoảng 33 amino acid (hình 1.2B). Những defensin này đƣợc tìm thấy ở mô hoa và quả những loài họ Cà.
1.3.1.3. Hoạt tính sinh học của defensin thực vật
Defensin thực vật hoạt động mạnh mẽ nhƣ là các protein ức chế, ảnh hƣởng đến chức năng kênh ion, ức chế quá trình dịch mã, tác động đến hoạt động của α – amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật, làm thay đổi trạng thái oxy hóa khử ascorbic acid. Hơn thế, defensin có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của nhiều loài nấm nhƣng lại không gây độc cho động vật có vú, tế bào thực vật và cả con ngƣời, sự xuất hiện hoạt tính kháng nấm của defensin đòi hỏi cần phải có sự liên kết chặt chẽ với màng đích [20]. Chẳng hạn Rs-AFP2 (defensin cây cải) làm ức chế quá trình phát triển của Phoma betae ở nồng độ 1 μg/ml [48].
Ngoài ra, defensin thực vật còn ức chế sự phát triển của một loạt các loại nấm, vi khuẩn Gram dƣơng/Gram âm và một số loại virus gây hại lƣơng thực. Theo nghiên cứu của Stotz và cs (2009) đã cho thấy defensin giúp cây có thể chống lại tác nhân gây bệnh [44]. Chức năng defensin không chỉ giới hạn ở hoạt tính kháng khuẩn, nó còn tham gia vào các tín hiệu tế bào và điều hoà sự tăng trƣởng. Defensin thực vật ở những tế bào ngoại biên của hạt cải [47], cơ quan hoa cây thuốc lá [26],
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lá cây đậu hay thân củ cà chua... đóng vai trò phòng tuyến bảo vệ đầu tiên, giúp hạn chế tổn thƣơng mô cây.
Tavares và cs (2008) [46], Stotz và cs (2009) [45] đã nghiên cứu defensin từ hoa. Kết quả cho thấy rằng defensin (DEF2) ở cà chua đƣợc thể hiện trong quá trình phát triển hoa sớm. Các nghiên cứu của Chen và cs (2002), Thomma và cs (2002) về defensin thực vật cũng đều khẳng định vai trò của defensin thực vật trong việc kháng lại sinh vật gây hại và chuyển gen defensin thực vật sẽ giúp tăng cƣờng khả năng kháng bệnh của cây [22], [50].
Cho đến nay hầu hết các defensin thực vật đƣợc đặc trƣng bởi khả năng kháng nấm mạnh, và các hoạt động diệt khuẩn. VuD1 là một defensin bất thƣờng có khả năng ức chế α – amylase của côn trùng gây hại. VuD1 đƣợc phân lập từ hạt cây đậu đũa (Vigna unguiculata) và đƣợc biểu hiện trong một hệ thống các chủng khác nhau. Pelegrini và cs (2008) đã tiến hành thí nghiệm với sự ức chế enzyme cho thấy hiệu quả ức chế α – amylase từ mọt Acanthoscelides obtectus và Zabrotes subfasciatus của VuD1 và nó gây ra sự ức chế thấp đối với enzyme ở động vật có vú và không thể ức chế α – amylase từ Callosobruchus maculatus và Aspergillus fumigatus. Để làm sáng tỏ hơn cơ chế hoạt động của VuD1, họ đã tiến hành phân tích mô hình phân tử và phát hiện ra đầu N của các phân tử chịu trách nhiệm liên kết với các vị trí enzyme hoạt động của mọt. Hơn nữa, mô hình VuD1 và enzyme ở động vật có vú cũng đƣợc làm sáng tỏ các cơ chế đặc thù. Nghiên cứu này của ông đã cho thấy rằng defensin này có ứng dụng tiềm năng trong việc phát triển cây trồng chuyển gen để kiểm soát côn trùng gây hại và đặc biệt là mọt ngô [40].
Bảng 1.5. Một số hoạt tính sinh học của defensin thực vật [24]
Hoạt tính sinh học Ví dụ Loài thực vật Nguồn
Kháng nấm Rs-AFP1-4 Ah-AMP1 AlfAFP Raphanus sativus Aesculus hippocastanum Medicago sativa [47], [48] [38] [24] Kháng khuẩn Pth-St1 Fabatin-1 và -2 SoD1-7 Solanum tuberosum Vicia faba Spinacia oleracea [37] [56] [54]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Diệt sâu VrCRP Vigna radiata [22]
Ức chế tổng hợp protein γ1-H γ1-P ω-H HvAMP1 Hordeum vulgare Triticum turgidium Hordeum vulgare Hardenbergia violacea [23] [35] [36] [27] Ức chế α-amylase SIα1-3 Sorghum bicolor [19] Ức chế proteinase CfD2 Cp-thionin Cassia fistula Vigna unguiculata [53] [34] Ức chế kênh Na+/K+ γ1-Z và γ2-Z Zea mays [43]
Defensin hoạt động theo những cơ chế khác nhau nhƣ sự tƣơng tác giữa tính thấm qua màng với các vị trí liên kết trên tế bào nấm, đặc biệt là với sphingolipid. DmAMP1, một loại defensin thực vật (Dahlia merckii) chỉ thể hiện hoạt tính kháng nấm Saccharomyces cerevisae khi có sự hiện diện của sphingolipid. Các phân tử sphingolipid đóng vai trò giữ ổn định cho protein neo glycosylphosphatidylinositol (GPI), qua đó tƣơng tác với DmAMP1, hoặc các sphingolipid này hoạt động nhƣ vùng gắn trực tiếp của DmAMP1 [49].
Defensin PA1b gồm 37 amino acid đƣợc phân lập từ hạt đậu (Pisum sativum)
có khả năng gây chết trong thời gian ngắn đối với một số loài côn trùng, trong đó có các loại mọt ngũ cốc Sitophilus sp. (Sitophilus oryzae, Sitophilus granarius, và
Sitophilus zeamais). PA1b là protein độc tố thực vật đầu tiên có khả năng gây độc chuyên biệt với côn trùng đƣợc công nhận. Đây chính là một công cụ hứa hẹn có thể sử dụng để kiểm soát thiệt hại do sâu mọt.
Defensin phong phú, biểu hiện hoạt động đa dạng, bao gồm cả sự ức chế các enzyme tiêu hóa trong ruột côn trùng và ức chế vi khuẩn hoặc nấm [26], [32], [50]. Liu và cs (2006) đã nêu rõ vai trò của defensin ở đậu xanh (VrD1) trong hoạt động chống côn trùng, gây ức chế hoạt động của enzyme tiêu hóa của côn trùng. Cơ chế gây độc của defensin đối với côn trùng (thƣờng là mọt) ở hạt đậu xanh là khi côn trùng phá huỷ những hạt ngô thì defensin đã ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của côn trùng và ức chế sự sinh trƣởng phát triển của chúng. Ở đây, defensin nhƣ là một tác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhân cản trở enzym
[33].