3. Nội dung nghiên cứu
1.3.2. Ứng dụng trong chuyển gen
Cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu diện rộng các đối tƣợng sâu bệnh, cũng nhƣ sẽ làm giảm sự phụ thuộc vào các chất bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Các nghiên cứu về các peptide đã giúp chúng ta hiểu hơn về cơ chế kháng bệnh, giúp tạo cây trồng chuyển gen góp phần cải thiện giống cây trồng. Ứng dụng các chất này trong chuyển gen mang lại hai ƣu điểm cơ bản. Đầu tiên, defensin thực vật có nguồn gốc từ hạt, rễ hay thân cây là những sản phẩm hoàn toàn tự nhiên. Chúng ít gây hại đối với con ngƣời. Thứ hai, giống nhƣ các protein khác, defensin thực vật phân hủy thành các nguyên tố tự nhiên một cách dễ dàng, về cơ bản sẽ không còn tồn dƣ bất kỳ “gốc hóa học” nào sau khi hiệu quả kháng nấm hết đi.
Bảng 1.6. Một số thực vật chuyển gen defensin [32]
Gen Cây cho Cây nhận Promoter Tăng tính kháng
đối với sinh vật Nguồn
Rs-AFP2 Củ cải Thuốc
lá CaMV 35S Alternaria longipes [47]
Rs-AFP2 Củ cải Thuốc lá
Nho CaMV 35S A. solani, Fusarium oxysporum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae [30] AlfAFP Cỏ linh
lăng Cà chua FMV 35S V. dahliae [24]
Spi1 Vân sam Thuốc lá CaMV 35S Erwinia carotovora,
Heterobasidion annosum [25]
DRR230-a Đậu Cải dầu CaMV 35S Leptosphaeria maculans [52]
DRR230-a
DRR230-c Đậu Thuốc lá CaMV 35S
F. oxysporum, Asochyta pinodes, Trichoderma reesei,
Ascochyta lentis,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ F. solani,
L. maculans, Ascochyta pisi, Alternaria alternata
BSD1 Cải thảo Thuốc lá CaMV 35S P. parasitica [39]
WT1 Mù tạt Gạo Ubiquitin-1 Magnaporthe grisea [29]
Đã có nhiều gen defensin đƣợc chuyển thành công vào thuốc lá, cà chua, nho, lúa gạo và đu đủ. Sự biểu hiện mạnh của defensin wasabi (WT1) ở lúa gạo, cà chua và phong lan giúp cây trồng tăng khả năng chống chịu các đối tƣợng gây bệnh nhƣ Magnaporthe grisea, Erwinia carotovora và Botrytis cinerea [32]. Những thế hệ cà chua khi đƣợc chuyển gen biểu hiện defensin ớt (cdef1) đều tăng khả năng kháng Phytophthora infestans và Fusarium sp. [55]. Đối với lúa gạo khi biểu hiện defensin thƣợc dƣợc (DmAMP1) giúp hạn chế sự phát triển của Magnaporthe oryzae và Rhizoctonia solani tƣơng ứng 84% và 72% [28]. Các thí nghiệm ở quy mô nhà kính cũng chỉ ra rằng đu đủ chuyển gen biểu hiện DmAMP1 có khả năng chống chịu tốt hơn với nấm P. palmivora [57]. Gao và cs đã nhận thấy rằng nhiều cây trồng chuyển gen tích lũy ở mức cao defensin cỏ linh lăng (AlfAFP) ở rễ và lá, chúng thể hiện khả năng kháng nấm tốt khi thử nghiệm ở quy mô nhà kính và đồng ruộng. Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng các gen defensin trong các sản phẩm thƣơng mại nhằm kiểm soát nấm [24].
Bên cạnh những báo cáo cho thấy sự biểu hiện thành công về mặt chức năng các defensin thực vật ở các đối tƣợng cây trồng nhƣ Arabidopsis (họ Cải), cà chua hay bông... thì ngƣời ta cũng thấy rằng một số defensin có thể gây độc khi biểu hiện liên tục. Chẳng hạn chúng làm chậm quá trình phát triển của tế bào, giảm hiệu suất tái sinh, khả năng sinh sản hay khiến cho hình thái cây chuyển gen thế hệ con không bình thƣờng... [17], [45].
Nhƣ vậy, defensin thực vật biểu hiện ở nhiều cơ quan khác nhau của cây và tạo ra phòng tuyến bảo vệ đầu tiên trƣớc các đối tƣợng sâu bệnh. Mặc dù sự tác động giữa defensin thực vật và nhiều đối tƣợng sâu bệnh còn chƣa đƣợc hiểu rõ,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhƣng những peptide này có thể đƣợc dùng để tạo ra cây trồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả năng chống chịu sâu bệnh. Thậm chí, hệ thống defensin thực vật hoàn toàn có thể sử dụng để biểu hiện ở ngƣời do sự tƣơng đồng về mặt cấu trúc và chức năng.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
Sử dụng 10 giống ngô (trong đó có 9 giống địa phƣơng) làm vật liệu nghiên cứu. Tên và nguồn gốc đƣợc trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách 10 giống ngô làm vật liệu nghiên cứu
STT Tên mẫu Nguồn gốc
1 SL1 Mộc Châu - Sơn La 2 SL2 Yên Châu - Sơn La 3 TQ1 Na Hang - Tuyên Quang 4 TQ2 Chiêm Hóa - Tuyên Quang 5 CB1 Hà Quảng - Cao Bằng 6 CB2 Quảng Uyên - Cao Bằng 7 ĐH Định Hóa - Thái Nguyên 8 LC Tam Đƣờng - Lai Châu 9 LS Cao Lộc - Lạng Sơn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.1. Hình thái hạt của 10 mẫu ngô thí nghiệm
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1. Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết nhập từ các hãng nổi tiếng của Mỹ, Đức, Hàn Quốc, Nhật Bản...:
- Các hóa chất dùng trong phân lập gen nhƣ Taq polymerase, buffer PCR, SDS, EDTA, Tris... của Invitrogen.
- Cặp mồi defensin đƣợc thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự gen defensin1 giống ngô đƣợc công bố tại GenBank – NCBI với mã số JF797205.
- Vector tách dòng pBT của Viện Công nghệ Sinh học.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR QIAquick Gel Extraction Kit, tinh sạch sản phẩm PCR AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer), bộ kit tách dòng TA Cloning Kit (Invitrogen), bộ kit tách plasmid tái tổ hợp AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer)...
- Các loại hóa chất khác: agarose, cồn tuyệt đối, sorbitol, chloroform... của Việt Nam, Trung Quốc sản xuất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng
STT Thiết bị Nguồn gốc, xuất xứ
1 Máy PCR Applied Biosystem - Mỹ
2 Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh 3 Bể ổn nhiệt Memmert - Đức
4 Máy ly tâm Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ 5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ
6 Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức 7 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu-425-400E Nuaire - Mỹ 8 Cân điện tử Precisa XB1200C - Đức
9 Máy lọc nƣớc deion AquaMax Ultra YoungUn - Hàn Quốc 10 Máy cất nƣớc Cascada Bio-Water - Pall Life - Mỹ/Anh 11 Máy đo quang phổ định lƣợng NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ 12 Máy DNA sequencing ABI Prism 3100 - Mỹ
13 Tủ lạnh -20oC Sanyo - Nhật Bản
14 Tủ lạnh -80oC Super Freezer Eco130 - Ficchetti - Ý 15 Tủ ấm IB-15G Jeiotech - Hàn Quốc
16 Bể ổn nhiệt BW-05G Jeiotech - Hàn Quốc Và một số thiết bị cần thiết khác nhƣ: ống eppendorf, đầu côn, pipet man,...
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp sinh lí
Để đánh giá nhanh khả năng kháng mọt của 9 giống ngô địa phƣơng và 1 giống lai đối chứng, chúng tôi đã thực hiện phƣơng pháp đánh giá tổn thất thức ăn theo tác giả Hà Quang Hùng [8].
Tính lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi đối với loài mọt ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lần và lô đối chứng (không thả mọt). Độ hao hụt do mọt tiêu hao đƣợc theo dõi sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần.
Cân 50g ngô cho vào 1 lọ nhựa, mỗi lọ nhựa thả 15 cặp mọt trƣởng thành. Trọng lƣợng thức ăn hao hụt đƣợc tính theo công thức:
P = 50 – Pt – P0 (g) Trong đó:
P: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm
Pt: trọng lƣợng thức ăn cân đƣợc sau một thời gian bảo quản P0: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng 50 g: trọng lƣợng thức ăn đƣa vào thí nghiệm
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Trƣớc hết, hạt ngô đƣợc xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động gen defensin1 theo phƣơng pháp của Wang và cs [51]. ABA pha trong ethanol với nồng độ 1g/1ml, sau đó pha loãng ABA 1 - 3%, ngâm hạt trong 6h rồi rửa sạch bằng nƣớc. Ngâm ủ hạt cho nảy mầm, đƣợc 5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách RNA tổng số. Quy trình tách RNA tổng số đƣợc thực hiện với TRIzol reagents (Invitrogen). Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều đƣợc khử DEPC 0,01%. - Nghiền mẫu trong nitơ lỏng băng chày cối đã khử trùng.
- Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút.
- Bổ sung 500µl chloroform:isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút. - Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40oC.
- Lấy 600µl dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Ly tâm 8000vòng/phút trong 20 phút ở 40 oC. - Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
- Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%). - Ly tâm 10000vòng/phút trong 10 phút. Lăp lại 2 lần. - Làm khô 5 phút.
- Pha loãng RNA trong 40µl nƣớc khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hết.
- Mẫu RNA thu đƣợc bảo quản trong tủ -84 oC.
2.3.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
- Tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo quy trình bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific):
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
H2O (DEPC) 5 µl
Mồi OligoT 1 µl
RNA khuôn 6 µl
Đảo đều nhẹ nhàng, ủ ở 65OC trong 5 phút. Sau đó để vào đá. Bổ sung:
5X Reaction Buffer 4 µl
RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl) 1 µl
dNTP 10mM 2 µl
RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200 u/µl) 1 µl
Tổng 20 µl
Ủ 25o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.3.2.3. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của RNA, DNA
- Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA, DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm. Hàm lƣợng và độ sạch của nucleic acid trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng RNA (ng/μl) = OD260×40× hệ số pha loãng. Hàm lƣợng DNA (ng/μl) = OD260×50× hệ số pha loãng. Độ sạch RNA (DNA) = OD260/OD280.
Trong đó:
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm
Nếu độ sạch RNA (DNA) = 1,8 - 2,0 thì mẫu đƣợc coi là sạch.
- Phƣơng pháp điện di
Điện di kiểm tra RNA, DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA, DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.2.4. Kỹ thuật PCR
- PCR nhân gen: sau khi tổng hợp cDNA, thực hiện nhân gen quan tâm với cặp mồi đặc hiệu của gen defensin1 (DEF1) theo phƣơng pháp của Sambrook và cs (2001) [41].
Bảng 2.4. Cặp mồi nhân gen defensin1
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DEF1-F CAC CAT GGC GCC GTC TCG ACG CA 58oC
DEF1-R CTA GCA GAT CTT CTT GCA GAA GC 58oC
- Thành phần phản ứng PCR nhân gen defensin1 ở ngô đƣợc trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nhân gen STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12 µl 2 cDNA 1 µl 3 Mồi DEF1-F (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi DEF1-R (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 10 µl Tổng 25 µl
- Chạy PCR với chu kỳ nhiệt:
- Kiểm tra sản phẩm: Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm: điện di sản phẩm nhân gen trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh.
2.3.2.5. Làm sạch sản phẩm PCR ∞ 3 phút 30 giây 94oC 94oC 30 giây 10 phút 72oC 72oC 30 giây 58oC 4oC 35 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Quá trình làm sạch sản phẩm PCR phục vụ việc tạo dòng đƣợc thực hiện với bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm và soi. - Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thƣớc yêu cầu).
- Bổ sung đệm hòa tan (GB – Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ƣớc 1μl tƣơng đƣơng 1mg mẫu).
- Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.
- Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.
- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC.
- Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen defensin1.
2.3.2.6. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.2. Cấu trúc vector pBT
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
STT Thành phần Thể tích 1 Buffer T4 ligase 10X 1,0 μl 2 DNA 5,0 μl 3 Vector pBT (150ng/µl) 1,0 μl 4 T4 ligase 1,0 μl 5 H2O 2,0 μl Tổng 10,0 μl
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22oC trong 3 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli
Sau khi thực hiện phản ứng nối gen quan tâm và vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
- Tế bào khả biến đƣợc lấy từ tủ -80oC và đƣợc để trong đá 10 phút.
- Lấy 5μl sản phẩm nối cho vào ống tế bào khả biến, đảo nhẹ. Để hỗn hợp trong đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, sau đó để ngay vào đá trong 10 phút.
bla (Amp) pBT
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Bổ sung 300μl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) để nuôi phục hồi trong 1 giờ ở 37oC, lắc 200 vòng/phút.
- Cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung carbenicillin, IPTG và X-gal.
- Ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Lấy dịch nuôi chứa khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR nhân gen defensin1, nhƣng DNA tổng số thay bằng DNA plasmid (2 µl). Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi nuôi cấy tế bào đã đƣợc biến nạp trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin, tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình sau:
- Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn.
- Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.
- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
- Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10