3. Nội dung nghiên cứu
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp sinh lí
Để đánh giá nhanh khả năng kháng mọt của 9 giống ngô địa phƣơng và 1 giống lai đối chứng, chúng tôi đã thực hiện phƣơng pháp đánh giá tổn thất thức ăn theo tác giả Hà Quang Hùng [8].
Tính lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi đối với loài mọt ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lần và lô đối chứng (không thả mọt). Độ hao hụt do mọt tiêu hao đƣợc theo dõi sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần.
Cân 50g ngô cho vào 1 lọ nhựa, mỗi lọ nhựa thả 15 cặp mọt trƣởng thành. Trọng lƣợng thức ăn hao hụt đƣợc tính theo công thức:
P = 50 – Pt – P0 (g) Trong đó:
P: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm
Pt: trọng lƣợng thức ăn cân đƣợc sau một thời gian bảo quản P0: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng 50 g: trọng lƣợng thức ăn đƣa vào thí nghiệm
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Trƣớc hết, hạt ngô đƣợc xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động gen defensin1 theo phƣơng pháp của Wang và cs [51]. ABA pha trong ethanol với nồng độ 1g/1ml, sau đó pha loãng ABA 1 - 3%, ngâm hạt trong 6h rồi rửa sạch bằng nƣớc. Ngâm ủ hạt cho nảy mầm, đƣợc 5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách RNA tổng số. Quy trình tách RNA tổng số đƣợc thực hiện với TRIzol reagents (Invitrogen). Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều đƣợc khử DEPC 0,01%. - Nghiền mẫu trong nitơ lỏng băng chày cối đã khử trùng.
- Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút.
- Bổ sung 500µl chloroform:isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút. - Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40oC.
- Lấy 600µl dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Ly tâm 8000vòng/phút trong 20 phút ở 40 oC. - Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
- Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%). - Ly tâm 10000vòng/phút trong 10 phút. Lăp lại 2 lần. - Làm khô 5 phút.
- Pha loãng RNA trong 40µl nƣớc khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hết.
- Mẫu RNA thu đƣợc bảo quản trong tủ -84 oC.
2.3.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
- Tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo quy trình bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific):
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
H2O (DEPC) 5 µl
Mồi OligoT 1 µl
RNA khuôn 6 µl
Đảo đều nhẹ nhàng, ủ ở 65OC trong 5 phút. Sau đó để vào đá. Bổ sung:
5X Reaction Buffer 4 µl
RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl) 1 µl
dNTP 10mM 2 µl
RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200 u/µl) 1 µl
Tổng 20 µl
Ủ 25o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.3.2.3. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của RNA, DNA
- Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA, DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm. Hàm lƣợng và độ sạch của nucleic acid trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng RNA (ng/μl) = OD260×40× hệ số pha loãng. Hàm lƣợng DNA (ng/μl) = OD260×50× hệ số pha loãng. Độ sạch RNA (DNA) = OD260/OD280.
Trong đó:
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm
Nếu độ sạch RNA (DNA) = 1,8 - 2,0 thì mẫu đƣợc coi là sạch.
- Phƣơng pháp điện di
Điện di kiểm tra RNA, DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA, DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.2.4. Kỹ thuật PCR
- PCR nhân gen: sau khi tổng hợp cDNA, thực hiện nhân gen quan tâm với cặp mồi đặc hiệu của gen defensin1 (DEF1) theo phƣơng pháp của Sambrook và cs (2001) [41].
Bảng 2.4. Cặp mồi nhân gen defensin1
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DEF1-F CAC CAT GGC GCC GTC TCG ACG CA 58oC
DEF1-R CTA GCA GAT CTT CTT GCA GAA GC 58oC
- Thành phần phản ứng PCR nhân gen defensin1 ở ngô đƣợc trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nhân gen STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12 µl 2 cDNA 1 µl 3 Mồi DEF1-F (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi DEF1-R (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 10 µl Tổng 25 µl
- Chạy PCR với chu kỳ nhiệt:
- Kiểm tra sản phẩm: Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm: điện di sản phẩm nhân gen trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh.
2.3.2.5. Làm sạch sản phẩm PCR ∞ 3 phút 30 giây 94oC 94oC 30 giây 10 phút 72oC 72oC 30 giây 58oC 4oC 35 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Quá trình làm sạch sản phẩm PCR phục vụ việc tạo dòng đƣợc thực hiện với bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm và soi. - Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thƣớc yêu cầu).
- Bổ sung đệm hòa tan (GB – Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ƣớc 1μl tƣơng đƣơng 1mg mẫu).
- Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.
- Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.
- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC.
- Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen defensin1.
2.3.2.6. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.2. Cấu trúc vector pBT
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
STT Thành phần Thể tích 1 Buffer T4 ligase 10X 1,0 μl 2 DNA 5,0 μl 3 Vector pBT (150ng/µl) 1,0 μl 4 T4 ligase 1,0 μl 5 H2O 2,0 μl Tổng 10,0 μl
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22oC trong 3 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli
Sau khi thực hiện phản ứng nối gen quan tâm và vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
- Tế bào khả biến đƣợc lấy từ tủ -80oC và đƣợc để trong đá 10 phút.
- Lấy 5μl sản phẩm nối cho vào ống tế bào khả biến, đảo nhẹ. Để hỗn hợp trong đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, sau đó để ngay vào đá trong 10 phút.
bla (Amp) pBT
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Bổ sung 300μl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) để nuôi phục hồi trong 1 giờ ở 37oC, lắc 200 vòng/phút.
- Cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung carbenicillin, IPTG và X-gal.
- Ủ đĩa ở 37oC trong 16 giờ. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Lấy dịch nuôi chứa khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR nhân gen defensin1, nhƣng DNA tổng số thay bằng DNA plasmid (2 µl). Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmid tái tổ hợp
Sau khi nuôi cấy tế bào đã đƣợc biến nạp trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin, tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình sau:
- Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn.
- Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.
- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
- Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
- Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
- Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tƣơng đƣơng isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
- Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
- Tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi M13, điện di để kiểm tra sản phẩm: tiến hành tƣơng tự phản ứng PCR, chỉ khác ở chỗ DNA lấy trực tiếp từ khuẩn lạc. Bảng 2.7. Thành phần phản ứng colony PCR STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 7,5 µl 2 DNA khuôn 1,0 µl 3 Mồi M13F (10pM/µl) 0,6 µl 4 Mồi M13R (10pM/µl) 0,6 µl 5 H2O 5,3 µl Tổng 15 µl Chu kỳ nhiệt: 2.3.3. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ∞ 3 phút 30 giây 94oC 94oC 30 giây 7 phút 72oC 72oC 30 giây 58oC 4oC 30 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các mẫu plasmid mang gen quan tâm có kích thƣớc phù hợp với lý thuyết đƣợc sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems – Mỹ).
2.3.4. Phương pháp xử lý trình tự gen
Sử dụng phần mềm BioEdit để phân tích và so sánh.
2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Sử dụng phƣơng pháp thống kê bằng chƣơng trình Microsoft Office Excel: xác định giá trị trung bình, phƣơng sai, độ lệch chuẩn, so sánh nhiều mẫu độc lập...[11].
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trình tự DNA đƣợc xác định trên thiết bị giải trình tự DNA tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer tại Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT
3.1.1. Đặc điểm hình thái, khối lượng của các giống ngô nghiên cứu
Hình thái và khối lƣợng hạt là những đặc tính quan trọng trong chọn giống ngô vì nó liên quan đến chất lƣợng và năng suất. Các mẫu ngô địa phƣơng đƣợc thu thập ở các tỉnh miền núi phía Bắc, mẫu đối chứng có nguồn gốc từ Viện nghiên cứu ngô. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng hạt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
STT Giống Hình thái hạt Màu vỏ hạt Khối lƣợng 1000 hạt (g) 1 SL1 Hạt tròn, mẩy Trắng vàng 291,80 ± 1,66 2 SL2 Hạt dẹt, mẩy Trắng ngà 235,39 ± 1,22 3 TQ1 Hạt tròn, nhỏ Trắng đục 201,71 ± 0,94 4 TQ2 Hạt tròn, mẩy Trắng tím 252,84 ± 1,03 5 CB1 Hạt tròn, mẩy Trắng ngà 266,81 ± 1,28 6 CB2 Hạt dẹt, nhỏ Trắng đục 171,41 ± 2,11 7 ĐH Hạt tròn, nhỏ Trắng vàng 189,29 ± 1,91 8 LC Hạt tròn, nhỏ Vàng cam 225,91 ± 1,50 9 LS Hạt nhỏ, mẩy Trắng đục 212,70 ± 1,75 10 NĐ Hạt tròn, mẩy Vàng nhạt 223,48 ± 0,50
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lƣợng 1000 hạt của 10 giống ngô dao động trong khoảng 171,41 ± 2,11 (g) đến 291,80 ± 1,66 (g). Cao nhất là giống SL1, thấp nhất là giống CB2. Thứ tự xếp hạng theo khối lƣợng từ cao xuống thấp cụ thể nhƣ sau:
SL1 > CB1 > TQ2 > SL2 > LC > NĐ > LS > TQ1 > ĐH > CB2
Tính trạng màu sắc và khối lƣợng đều do gen quy định. Tuy nhiên, tính trạng màu sắc ít chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng. Trong khi đó, tính trạng khối lƣợng có thể thay đổi nếu chịu các tác động ngoại cảnh của môi trƣờng vào các giai đoạn phát triển khác nhau của cây.
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt
Mọt thƣờng tấn công vào phôi trƣớc, sau đó đến nội nhũ và các bộ phận khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Thời gian phá hoại của mọt trong chu kỳ sinh trƣởng tƣơng đối dài. Năng suất, chất lƣợng ngô bị ảnh hƣởng nhiều khi bị mọt tấn công. Defensin thực vật ức chế hoạt động của α-amylase trong ruột mọt bằng cách gắn kết với trung tâm hoạt động của enzyme, do đó ức chế quá trình tiêu hóa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tinh bột. Để đánh giá khả năng kháng mọt của các mẫu ngô nghiên cứu, chúng tôi dựa vào việc tính toán lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi (1 – 2 – 3 – 4 tuần) đối với loài mọt ngô Sitophilus zeamais. Mỗi lọ thí nghiệm chứa 50 g ngô hạt và thả vào đó 15 cặp mọt trƣởng thành. Kết quả thu đƣợc số liệu ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 10 giống ngô nghiên cứu (đơn vị: gam)
Giống 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần Trung bình
SL1 0,37 ± 0,04 2,54 ± 0,08 4,86 ± 0,32 7,1 ± 0,25 3,72 SL2 0,48 ± 0,05 1,84 ± 0,07 5,15 ± 0,23 7,22 ± 0,21 3,67 TQ1 0,22 ± 0,04 1,52 ± 0,08 2,77 ± 0,12 5,49 ± 0,23 2,50 TQ2 2,96 ± 0,07 7,27 ± 0,08 14,48 ± 0,44 21,09 ± 0,20 11,45 CB1 0,32 ± 0,05 2,26 ± 0,05 4,74 ± 0,33 6,95 ± 0,25 3,57 CB2 5,42 ± 0,08 14,54 ± 0,34 23,62 ± 0,77 31,16 ± 0,53 18,69 ĐH 3,32 ± 0,05 8,9 ± 0,21 15,69 ± 0,38 22,58 ± 0,42 12,62 LC 1,95 ± 0,06 5,52 ± 0,17 9,51 ± 0,50 14,14 ± 0,56 7,78 LS 2,89 ± 0,06 8,58 ± 0,09 14,72 ± 0,52 21,56 ± 0,66 11,94 NĐ 0,57 ± 0,06 2,62 ± 0,06 5,07 ± 0,15 8,35 ± 0,09 4,15 Trung bình 1,85 5,56 10,06 14,56
Bảng 3.2 cho ta thấy sau 1 - 2 - 3 - 4 tuần, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều bị mọt xâm hại, mức độ thức ăn hao hụt tăng theo thời gian: Sau 1 tuần, lƣợng ngô hao hụt trung bình ở các mẫu nghiên cứu là 1,85 g; sau 2 tuần là 5,56 g; sau 3 tuần là 10,06 g; sau 4 tuần là 14,56 g.
Để kiểm tra xem lƣợng ngô hao hụt ở các mẫu thí nghiệm trên có thực sự khác nhau hay không, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp so sánh nhiều mẫu độc lập