2.3.1. Phương pháp xác định độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau
- Tiến hành khảo sát độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat có pH lần lượt là 3, 4, 5, 6, và 7,4.
- Cân một lượng dư AMB (khoảng 0,1 g AMB), cho vào bình nón có nắp đậy dung tích 250 ml, thêm khoảng 100 ml môi trường khảo sát, khuấy từ liên tục trong 24 h, ở nhiệt độ phòng (khoảng 25 ºC).
- Sau 24 h, hút khoảng 5 ml dịch, đem li tâm ở tốc độ 12 000 v/p, nhiệt độ phòng, trong 30 phút để loại phần AMB không tan. Lấy phần dịch phía trên, đem lọc qua màng celulose acetat 0,45 µm.
- Tiến hành xác định nồng độ của AMB trong từng môi trường bằng phương pháp HPLC với các điều kiện đã mô tả ở mục 2.3.3.3.1, thu được diện tích peak tương ứng Si.
- Xác định nồng độ AMB (Ci) trong từng môi trường bằng phương pháp so sánh diện tích peak với dung dịch AMB chuẩn pha trong dung môi thử có nồng độ Co, diện tích peak S0 xác định: Ci = × Co.
2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB
Nghiên cứu đã tiến hành lựa chọn phương pháp bốc hơi pha đảo để bào chế liposome AMB.
Quy trình bào chế liposome AMB như sau:
Cân và hòa tan AMB trong 50 ml methanol (0,2 mg AMB/ml methanol). Cân và hòa tan SPC, chol trong 15 ml chloroform.
Phối hợp 2 dung dịch trên, khuấy trộn để thu được dung dịch đồng nhất. Chuyển dung dịch lipid vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay. Tiến hành cất quay ở điều kiện nhiệt độ 40 – 41 ºC, tốc độ quay 150 vòng/phút (v/p). Hệ thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ. Sau 30 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết, tiếp tục cất quay 3 giờ để loại dung môi một cách hoàn toàn.
Hòa tan trở lại hỗn hợp lipid và AMB bằng 30 ml diethyl ether. Chuyển hỗn hợp sang bình định mức dung tích 100 ml có nắp đậy, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat. Siêu âm liên tục trong bể siêu âm (có làm lạnh) trong 15 phút, nhiệt độ: 10 - 20 ºC tạo nhũ tương N/D.
Cho nhũ tương vào bình cất quay của hệ thống cất quay. Tiến hành cất quay dưới áp suất giảm để loại diethyl ether với điều kiện: tốc độ quay của bình cầu 100 v/p, ở nhiệt độ phòng, điều chỉnh áp suất để quá trình bốc hơi dung môi diễn ra một cách từ từ. Sau 15 phút, diethyl ether bay hơi hoàn toàn, hệ chuyển sang trạng thái gel. Tiếp tục bốc hơi dung môi, sau 10 phút trạng thái gel bị phá vỡ và tạo thành liposome. Cất quay thêm 1h để loại hoàn toàn dung môi hữu cơ.
Hỗn dịch liposome thu được đem đùn ép qua màng polycarbonat với kích thước lỗ màng lần lượt là 400 – 200 – 100 nm (mỗi loại màng đùn qua 29 lần), ở nhiệt độ 50 ºC, thu được hỗn dịch liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất.
Liposome AMB được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy bạc và bảo quản ở 2 – 8 ºC.
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome AMB