Sử dụng kỹ thuật phân tích nhiệt vi sai (DSC) để xác định nhiệt độ chuyển pha của lớp màng lipid nhằm đánh giá sự tương tác lí hóa của SPC, chol và AMB trong cấu trúc liposome:
+ Liposome đem li tâm ở tốc độ 12000 v/p, trong 45 phút, ở 5 ºC, loại bỏ phần dịch phía trên, hỗn dịch liposome đặc đem đặt trong bình hút ẩm, áp suất thường, trong 5 ngày để loại nước.
+ Cân khoảng 2 – 5 mg liposome đã mất nước, đặt trong pan nhôm có thể tích 40 µL, hàn nắp pan nhôm.
+ Quét nhiệt trong khoảng từ 0 – 250 ºC, tốc độ gia nhiệt 5 ºC/phút.
+ Tiến hành phân tích đối với các mẫu: SPC, chol và liposome AMB có tỷ lệ các thành phần khác nhau để đánh giá ảnh hưởng của AMB, chol đối với nhiệt độ chuyển pha (Tc) của SPC.
2.3.3.3.Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa 2.3.3.3.1. Phương pháp định lượng AMB trong liposome
Xác định hàm lượng AMB trong liposome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [7]:
- Cột sắc kí: cột Cosmosil 5C18 – MS - II, kích thước cột 250 × 4,6 mm; đường kính hạt nhồi 5 µm.
- Pha động: hỗn hợp acetonitril (ACN) và natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) với tỷ lệ 40: 60 về thể tích (v/v).
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.
- Detector UV, bước sóng 405 nm.
Pha mẫu chuẩn và mẫu thử Mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 0,005 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 100ml, bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch gốc có nồng độ 50 µg/ml. Hút chính xác một thể tích xác định dung dịch gốc, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi ACN: natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) tỷ lệ 60:40 v/v, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp. Lọc dung dịch qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.
Mẫu thử:
Hút chính xác 0,5 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol: chloroform tỷ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi ACN: natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) tỷ lệ 60:40 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Lọc mẫu qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.
Hàm lượng AMB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:
CT = Trong đó:
CT : nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome (mg/ml). St: diện tích peak mẫu thử (mAU.s)
Sc: diện tích peak mẫu chuẩn (mAU.s) mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg).
k: hệ số pha loãng.
2.3.3.3.2. Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome thô. Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch liposome thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.3.3.1. Tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak là S1.
Định lượng AMB gắn trong lớp lipid của liposome: để đánh giá được lượng AMB gắn trong lớp lipid cần loại bỏ phần AMB tự do. AMB tự do không tan trong nước sẽ kết tủa và bị loại đi trong quá trình đùn ép qua màng polycacbonat có kích thước lỗ màng lần lượt là 400 – 200 – 100 nm. Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch liposome sau khi đùn ép, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.3.3.1. Tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak là S2.
Hiệu suất liposome hóa được xác định bằng công thức: H % =
×
100%.2.3.3.4.Tính ổn định của liposome AMB
Đánh giá KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất liposome hóa khi bảo quản ở 2 – 8 ºC sau 1 tuần.
2.4. Điều kiện thí nghiệm
AMB bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và đánh giá cần tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng AMB 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí
- Chuẩn bị dung dịch AMB chuẩn có nồng độ khoảng 20 µg/ml.
- Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc kí với điều kiện sắc kí như mô tả ở mục 2.3.3.3.1, theo dõi thời gian lưu (tR), diện tích peak (Speak). Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí
STT Thời gian lưu (tR) (phút)
Diện tích peak (Spic) (mAU.s) 1 6,289 2054,48 2 6,293 2063,90 3 6,324 2063,23 4 6,363 2059,59 5 6,387 2055,74 6 6,411 2041,70 6,344 2056,44 SD 0,05 8,16 RSD % 0,79 0,39 Nhận xét:
Điều kiện sắc kí cho kết quả có độ lặp lại cao về thời gian lưu, diện tích peak với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2 %, chứng tỏ hệ thống sắc kí trên đảm bảo tính thích hợp cho phép định lượng AMB.
3.1.2. Độ đặc hiệu
- Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ AMB tương đương nhau (mục 2.3.3.3.1).
- Chuẩn bị mẫu trắng là liposome trắng có thành phần SPC và chol tương tự mẫu thử và được pha loãng giống mẫu thử.
- Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng qua cột sắc kí, đánh giá peak sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ.
Kết quả cho thấy: xuất hiện peak cân xứng, có thời gian lưu (tR) 6,3 phút trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không xuất hiện peak ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng (phụ lục 1). Chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất AMB có thời gian lưu trung bình 6,3 phút với điều kiện sắc kí trình bày ở mục 2.3.3.3.1.
3.1.3. Tính tuyến tính
- Pha dãy dung dịch AMB chuẩn có nồng độ lần lượt là 10, 15, 20, 25, 30, 35 µg/ml.
- Tiến hành tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak của từng nồng độ dung dịch AMB chuẩn.
- Kết quả diện tích peak của các dung dịch AMB chuẩn được thể hiện ở bảng 3.2, sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak được thể hiện ở hình 3.1.
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak
STT Nồng độ AMB (µg/ml) Diện tích peak (mAU.s)
1 10 898,73 2 15 1440,59 3 20 1936,00 4 25 2451,70 5 30 2952,27 6 35 3502,187
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak
Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ AMB với diện tích peak trong khoảng nồng độ từ 10 – 35 µg/ml với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
3.1.4. Độ lặp lại
- Tiến hành định lượng 6 lần với một mẫu thử, mỗi lần định lượng tiêm mẫu 3 lần và lấy diện tích peak trung bình.
- Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3.
Nhận xét: Phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối < 2 %.
3.1.5. Giới hạn phát hiện
- Tiến hành pha một dãy dung dịch AMB chuẩn có nồng độ thấp: 1; 0,5; 0,1; 0,05 µg/ml.
- Tiêm lần lượt từng mẫu chuẩn có nồng độ giảm dần vào hệ thống sắc kí, quan sát sự có mặt của peak có thời gian lưu 6,3 phút trên sắc kí đồ.
- Kết quả cho thấy: ở nồng độ 0,1 µg/ml vẫn thấy xuất hiện peak trên sắc kí đồ, còn ở nồng độ 0,05 µg/ml không thấy xuất hiện peak với thời gian lưu 6,3 phút trên sắc kí đồ. Như vậy, phương pháp có khả năng phát hiện dược chất ở khoảng nồng độ từ 0,1 µg/ml trở lên.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí
STT Diện tích peak (mAU.s)
1 1524,43
2 1552,8
3 1566,3
4 1572,26
5 1552,38
6 1545
1552,2
SD 16,87
RSD % 1,08
Kết luận: Phương pháp định lượng AMB bằng HPLC có tính thích hợp, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại cao. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này để định lượng AMB trong chế phẩm liposome.
3.2. Độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau
Kết quả xác định độ tan bão hòa AMB trong các môi trường đệm phosphat pH 3, 4, 5, 6 và 7,4 bằng phương pháp HPLC cho thấy: không xuất hiện peak của AMB có thời gian lưu trung bình 6,3 phút trên sắc kí đồ. Chứng tỏ, độ tan bão hòa của AMB trong các môi trường này nhỏ hơn giới hạn phát hiện (0,1 µg/ml) của phương pháp định lượng.
Như vậy, AMB tự do nếu có trong hỗn dịch liposome sẽ tồn tại chủ yếu dưới dạng kết tủa, hầu như không tồn tại ở dạng phân tử hòa tan.
Kết quả thử nghiệm độ tan bão hòa của AMB trong các môi trường đệm trên cũng cho thấy việc sử dụng túi thẩm tích (chỉ cho các phân tử kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ màng thẩm thấu qua) rất khó để loại hết AMB tự do tồn tại ở dạng kết tủa trong hỗn dịch liposome và để định lượng được nồng độ AMB tự do tồn tại ở dạng phân tử hòa tan trong môi trường hydrat hóa đòi hỏi các phương pháp định lượng có độ nhạy cao hơn như sắc kí khối phổ hay sắc kí khí.
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome AMB đặc tính của liposome AMB
3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược và pH môi trường hydrat hóa đến một số đặc tính của liposome AMB bằng cách cố định tỷ lệ % mol dược chất/ tổng lượng lipid là 2 %, thay đổi tỷ lệ mol SPC: chol và pH môi trường hydrat hóa. Các thành phần công thức được mô tả ở bảng 3.4.
Tiến hành bào chế các công thức theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2.
Bảng 3.4. Thành phần các công thức bào chế liposome AMB
Công thức SPC (µmol) Chol (µmol) SPC: Chol (tỷ lệ mol) AMB (µmol) % mol AMB/ tổng lipid pH môi trường hydrat hóa A552 250 250 5:5 10 2 7,4 A642 300 200 6:4 10 2 7,4 A732 350 150 7:3 10 2 7,4 A822 400 100 8:2 10 2 7,4 A912 450 50 9:1 10 2 7,4 B552 250 250 5:5 10 2 4,0 B642 300 200 6:4 10 2 4,0 B732 350 150 7:3 10 2 4,0 B822 400 100 8:2 10 2 4,0 B912 450 50 9:1 10 2 4,0
Trong đó, các công thức nhóm A sử dụng môi trường đệm phosphat pH 7,4, công thức nhóm B sử dụng môi trường đệm phosphat pH 4,0 làm môi trường hydrat hóa.
3.3.2. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB
3.3.2.1.Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB
- Về hình thức cảm quan: các công thức sau khi bào chế đều thu được hỗn dịch màu vàng đục, không quan sát thấy các tinh thể dược chất và các tiểu phân có kích thước lớn (hình 3.2). Sau bảo quản 1 ngày ở 2 – 8 ºC không thấy hiện tượng lắng cặn.
Hình 3.2. Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế
- Quan sát hình ảnh chụp TEM cho thấy, các tiểu phân có cấu trúc hình cầu, đơn hoặc đa lớp, phân bố KTTP tương đối đồng nhất (Phụ lục 2).
- KTTP, phân bố KTTP được trình bày trong bảng 3.5 và đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu được thể hiện ở hình 3.3, 3.4, 3.5.
Bảng 3.5. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu liposome AMB
Công thức Zaverage (d.nm) PDI Peak 1 (d.nm) Peak 2 (d.nm) Peak 3 (d.nm) % peak 1 % peak 2 % peak 3 A552 273,3 0,324 466,3 0 0 100 0 0 A642 253,2 0,284 192,6 706,1 0 56,5 43,5 0 A732 246,5 0,249 313,1 5007 0 98,9 1,1 0 A822 200,4 0,23 205,0 1885 4282 89,9 6,3 3,8 A912 167,3 0,24 200,2 4215 0 96,2 3,8 0 B552 246,1 0,262 345,3 0 0 100 0 0 B642 168,7 0,247 174,2 4485 0 93,9 6,1 0 B732 166,4 0,232 184,7 4502 0 95,6 4,4 0 B822 159,8 0,177 201,8 0 0 100 0 0 B912 143,7 0,140 153,6 5117 0 98,9 1,1 0 Sau khi đùn Trước khi đùn
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome nhóm A
Nhận xét:
Từ các kết quả thu được ở trên cho thấy với cùng một tỷ lệ dược chất/tổng lượng lipid sử dụng thì:
+ Các mẫu liposome thu được có KTTP nhỏ từ 143,7 – 273,3 nm, khoảng kích thước này lớn hơn nhiều so kích thước của lỗ màng polycarbonat, phân bố KTTP của các mẫu tương đối đồng nhất (PDI < 0,3) trừ công thức A552.
+ KTTP của các mẫu liposome nhóm A sử dụng đệm phosphat pH 7,4 làm môi trường hydrat hóa có xu hướng cao hơn KTTP của các mẫu liposome nhóm B sử dụng đệm phosphat pH 4,0 làm môi trường hydrat hóa.
+ Khi tăng tỷ lệ SPC, giảm tỷ lệ chol thì hỗn dịch liposome thu được có KTTP nhỏ hơn và đồng nhất hơn (giá trị PDI có xu hướng giảm).
Nguyên nhân của hiện tượng trên là do:
Sự có mặt của cholesterol làm cho lớp màng lipip kép trở nên cứng chắc hơn, giảm tính linh động của lớp màng lipid khiến cho các tiểu phân liposome khó đi qua màng polycarbonat trong quá trình đùn ép giảm KTTP. Điều này còn dẫn đến việc khi tăng tỷ lệ cholesterol thì lực nén tác động để đẩy hỗn dịch liposome qua màng polycacbonat tăng, làm giảm tính chất nguyên vẹn của lớp màng lọc. Thêm vào đó, sự có mặt của kết tủa AMB trong hỗn dịch cũng cản trở quá trình đùn do làm bít tắc các lỗ màng và ảnh hưởng đến kết quả đo.
Kết quả phân tích DSC các mẫu liposome A552 và A912 có tỷ lệ chol khác
nhau cho thấy không còn xuất hiện peak nhiệt độ chuyển pha của SPC trên phổ
DSC (phụ lục 4). Chứng tỏ sự có mặt của dược chất trong lớp màng lipid kép làm
mất nhiệt độ chuyển pha (Tc) của SPC. Hiện tượng này là do các phân tử AMB xen
vào lớp màng lipid kép và lấp đầy khoảng trống không gian giữa các phân tử
phospholipd, làm cản trở quá trình quay chuyển dạng cấu trúc không gian của mạch
hydrocarbon của phân tử phospholipid, khi đó lớp màng lipid kép tồn tại ở 1 trạng
thái duy nhất trong suốt quá trình gia nhiệt, trạng thái này được gọi là trạng thái tinh
thể lỏng sắp xếp một cách có trật tự Lo(ordered liquid - crystalline phase) [13]. Kết
quả cũng cho thấy khi có mặt AMB trên lớp màng lipid thì sự tồn tại trạng thái Lo
không phụ thuộc vào nồng độ cholesterol.
Do có sự tồn tại ở lớp màng lipid ở trạng thái Lo nên dù có tăng nhiệt độ lên 50 ºC trong quá trình đùn thì vẫn không làm cho lớp màng lipid linh động, mềm dẻo hơn để có thể thu được các hỗn dịch liposome có kích thước đồng nhất.
3.3.2.2.Hiệu suất liposome hóa
Hiệu suất liposome hóa được đánh giá theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3. Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.6.
Bảng 3.6. Hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome AMB
Công thức SPC: Chol (tỷ lệ mol) % mol AMB/ tổng lipid pH môi trường phân tán Hiệu suất liposome hóa A552 5:5 2 7,4 77,65 A642 6:4 2 7,4 77,05 A732 7:3 2 7,4 75,4 A822 8:2 2 7,4 73,7 A912 9:1 2 7,4 71,7 B552 5:5 2 4,0 67,7 B642 6:4 2 4,0 60,8 B732 7:3 2 4,0 59,0 B822 8:2 2 4,0 57,9 B912 9:1 2 4,0 50,02
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome
Nhận xét:
Các mẫu liposome thu được có hiệu suất liposome hóa cao từ 50 – 77,65 %, trong đó mẫu cho hiệu suất cao nhất là công thức A552 (hiệu suất liposome hóa đạt 77,65 %).
Khi giảm tỷ lệ cholesterol thì hiệu suất lipsome hóa giảm. Nguyên nhân là do cholesterol tương tác với nhóm thân dầu của phân tử phospholipid làm cho các phân tử này liên kết bền chặt hơn, do đó tăng khả năng gắn giữ các phân tử AMB trong quá trình phá vỡ cấu trúc micel đảo để hình thành tiểu phân liposome (quá trình đảo pha) [15]. Hơn nữa do đặc điểm cấu trúc của AMB làm cho phân tử này có ái lực cao với các sterol (ergosterol, cholesterol) và tạo thành phức hợp liên kết giữa AMB – sterol. Do đó, khi tăng tỷ lệ chol trong lớp màng lipid làm tăng ái lực của AMB
