NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E.

 Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố tá dược và thời gian siêu âm đến kích thước tiểu phân và khả năng giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano. Đánh giá một số tính chất của hệ tiểu phân nano.

 Bào chế gel chứa hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E.

 Đánh giá một số tính chất của gel chứa hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp bào chế

2.3.1.1. Bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E

Hình 2.1. Sơ đồ bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E

70 – 80oC Đun chảy Hòa tan Phối hợp ở 70 – 80oC Siêu âm tần số 30000 Hz biên độ 100 µm Để nguội

Hệ tiểu phân nano lipid rắn Lipid rắn + CDH thân dầu

Vitamin E Hòa tan CDH thân nước Nước cất vđ Khuấy từ tốc độ 700 vòng/phút 20 phút

Bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E bằng phương pháp siêu âm kết hợp khuấy từ. Quá trình được tiến hành như sau:

 Lipid rắn và chất diện hoạt thân dầu được đun chảy ở 70 – 80C trong bát sứ, sau đó hòa tan vitamin E đến khi thu được dung dịch trong suốt. Duy trì nhiệt độ.

 Hòa tan CDH thân nước vào nước vừa đủ, duy trì nhiệt độ 70 – 80oC và đem khuấy từ ở tốc độ 700 vòng/phút kèm siêu âm ở tần số 30000 Hz, biên độ 100 µm.

 Đổ từ từ pha lipid vào pha nước và tiếp tục siêu âm, khuấy từ trong 20 phút.

 Để nguội mẫu ở nhiệt độ phòng.

Quá trình bào chế luôn sử dụng biện pháp tránh ánh sáng cho các thành phần chứa vitamin E. Mẫu sau khi bào chế được đựng trong lọ thủy tinh, bọc giấy nhôm bên ngoài.

2.3.1.2. Bào chế gel từ SLNs chứa vitamin E

Qua tham khảo tài liệu [2] và quá trình khảo sát sơ bộ, gel chứa hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E được xây dựng công thức như sau:

Hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E

Carbopol 940

Triethanolamin

Glycerin

Nước cất vừa đủ Quy trình bào chế gel được tóm tắt trong hình 2.2, cụ thể:

 Ngâm Carpobol 940 trương nở hoàn toàn trong nước, thêm triethanolamin, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng, một chiều được hỗn hợp 1.

 Hòa tan glycerin vào hệ tiểu phân nano lipid rắn vitamin E trong cốc có mỏ thu được hỗn hợp 2.

 Phân tán từ từ từng ít một hỗn hợp 2 vào hỗn hợp 1, khuấy nhẹ nhàng, một chiều.

 Bổ sung nước vừa đủ, từng ít một, khuấy nhẹ nhàng, một chiều đến khi thu được gel mịn và đồng nhất.

2.3.2. Phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin E

2.3.2.1. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E và độ hấp thụ UV-VIS

Cân chính xác khoảng 0,1250 g vitamin E (alpha tocopherol acetat), hòa tan trong ethanol vừa đủ 50 ml được dung dịch A. Lấy 1 ml dung dịch A, pha loãng với ethanol vừa đủ 25 ml, thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 100 μg/ml. Quét phổ dung dịch vừa pha bằng máy đo quang phổ UV-VIS HITACHI U1800 trong dải bước sóng từ 200 – 400 nm. Xác định bước sóng tại đỉnh hấp thụ cực đại.

Lấy 5 ml dung dịch A pha loãng bằng ethanol vừa đủ 25 ml. Từ dung dịch này đem pha loãng tiếp với ethanol để được các dung dịch có nồng độ 25; 50; 75; 100; 125; 150; 175 và 200 μg/ml. Đo độ hấp thụ UV-VIS của dãy 8 dung dịch này tại bước sóng cực đại xác định ở trên. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E trong dung môi ethanol theo mật độ quang.

2.3.2.2. Đánh giá sự giải phóng vitamin E từ hệ tiểu phân nano a. Điều kiện thử giải phóng

Ngâm trương nở

Khuấy nhẹ nhàng

Phối hợp từng ít một, khuấy nhẹ nhàng, một chiều

Bổ sung nước cất vừa đủ, từng ít một, khuấy nhẹ nhàng, một chiều

Gel chứa SLNs vitamin E Carbopol 940

Triethanolamin

Hòa tan glycerin trong SLNs vitamin E

Qua tham khảo tài liệu [2], [31] và xét đến điều kiện cơ sở vật chất hiện có, hàm lượng vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân nano được đánh giá bằng hệ thống giải phóng qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể như sau:

 Màng giải phóng: màng cellulose acetat 0,2 μm (ngâm bão hòa môi trường giải phóng trong 20 phút trước khi thử); diện tích thử 1,767 cm2.

 Môi trường giải phóng: ethanol tuyệt đối.

 Thể tích môi trường giải phóng: 7 ml.

 Nhiệt độ thử: 37C.

 Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.

 Thể tích mẫu thử: 1 ml.

 Ngăn cho là vòng chứa mẫu có đường kính trong bằng đường kính trong của ngăn nhận và chiều cao vừa đủ để ngăn chứa được 1 ml hệ tiểu phân nano.

b. Chuẩn bị mẫu chuẩn, cách thức tiến hành và xác định hàm lượng vitamin E giải phóng

 Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,1250 g vitamin E. Hòa tan trong ethanol vừa đủ 100 ml. Lấy 1 ml dung dịch này pha loãng bằng ethanol trong bình định mức 25 ml được dung dịch vitamin E chuẩn có nồng độ 50 μg/ml.

 Tiến hành thử.

Tại thời điểm t = 0 phút, bơm chế phẩm thử vào ngăn cho. Tiến hành lấy mẫu là môi trường giải phóng tại các thời điểm t = 30, 60, 120, 180 phút. Thể tích mỗi lần lấy là 1 ml. Quá trình lấy mẫu đồng thời cũng là quá trình thêm môi trường giải phóng vào ngăn nhận với thể tích bằng thể tích môi trường đã lấy ra. Mẫu môi trường lấy ra đem pha loãng 5 lần bằng dung môi thử giải phóng. Xác định lượng vitamin E giải phóng bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 286 nm rồi đem so sánh với mẫu chuẩn.

 Xác định hàm lượng vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân nano.

Sau thời gian t1 = 30 phút, tỷ lệ vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân tính theo công thức:

X1 (%) = (A1

Ac × Cc× 10

−6× 5 × 7) × 100

𝑚1× m× 100(%)

Sau thời gian tk phút (k = 2, 3, 4), tỷ lệ vitamin E giải phóng từ hệ tiểu phân được tính theo công thức:

Xk (%) = (Ak× 7 + ∑ Ai k−1 i=1 ) ×Cc Ac× 10 −6× 5 × 100 𝑚1× m× 100(%) Trong đó:

+ Ac, Ak tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn và dung dịch môi trường giải phóng lấy tại thời điểm tk phút (k = 2, 3, 4).

+ 5 là hệ số pha loãng của mẫu môi trường giải phóng lấy được. + 7 là thể tích môi trường giải phóng có trong ngăn nhận (ml). + m1 là khối lượng của 1 ml mẫu SLNs đem thử (g).

+ m là khối lượng vitamin E trong 100 g mẫu tính theo lý thuyết (g).

2.3.2.3. Định lượng nồng độ vitamin E trong hệ tiểu phân nano

Ở đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để định lượng vitamin E trong hệ tiểu phân nano lipid rắn.

a. Điều kiện sắc ký

Qua tham khảo tài liệu [18] kết hợp với quá trình khảo sát tách vitamin E bằng phương pháp HPLC, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

 Pha động: là hỗn hợp methanol : nước cất (98 : 2), được siêu âm trong 15 phút.

 Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

 Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

 Detector UV phát hiện ở bước sóng 284 nm.

 Nhiệt độ: nhiệt độ phòng.

b. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ vitamin E

Cân chính xác khoảng 0,0250 g vitamin E (alpha tocopherol acetat), hòa tan trong methanol vừa đủ 50 ml thu được dung dịch có nồng độ 500 μg/ml, lọc qua màng 0,45 μm. Từ dung dịch này pha loãng bằng methanol thành các dung dịch có nồng độ 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 μg/ml, chạy HPLC với điều kiện được trình

bày trong mục 2.3.2.3 a. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ vitamin E với diện tích pic.

c. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử, xác định hàm lượng vitamin E

 Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0500 g vitamin E, hòa tan trong methanol vừa đủ 25 ml. Lấy 1 ml dung dịch này pha loãng 10 lần bằng methanol được dung dịch có nồng độ 200 µg/ml. Lọc qua màng 0,45 µm.

 Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,5000 g mẫu SLNs vitamin E, hòa tan hoàn toàn trong khoảng 20 ml ethanol, rồi bổ sung ethanol vừa đủ 25 ml. Lọc qua màng 0,45 µm.

 Xác định hàm lượng vitamin E bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hàm lượng vitamin E (%) có trong hệ tiểu phân nano so với hàm lượng lý thuyết tính theo công thức sau:

𝐻(%) = 𝑆𝑡

𝑆𝑐 × 𝐶𝑐 × 10

−6× 25 × 100

𝑚1× 𝑚× 100 (%)

Trong đó:

+ Sc, St tương ứng là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử (mAU.s). + Cc là nồng độ dung dịch vitamin E chuẩn (µg/ml).

+ 25 là hệ số pha loãng của dung dịch thử.

+ m1 là khối lượng mẫu SLNs vitamin E đem định lượng (g).

+ m là khối lượng vitamin E có trong 100 g SLNs tính theo lý thuyết (g).

2.3.2.4. Đánh giá hình thái và kích thước hệ tiểu phân nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Hình thái và kích thước của các tiểu phân trong hệ nano lipid rắn được quan sát qua kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1010 có độ phóng đại M = x50 – x600.000, độ phân giải  = 3A, điện áp gia tốc U = 40 – 100 kV.

Phương pháp tiến hành dựa trên nguyên tắc: dùng các chùm điện tử đi qua mẫu vật để tạo ảnh mẫu nghiên cứu, hiện ảnh lên màn hình huỳnh quang với độ phóng đại theo yêu cầu.

2.3.2.5. Đánh giá kích thước và phân bố kích thước bằng máy Zetasizer Nano ZS90

Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ lase. Nguyên lý của phương pháp là khi chiếu chùm tia lase vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được kích thước tiểu phân.

Sử dụng máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano ZS90 đo kích thước hạt trong khoảng 0,01 – 10000 nm. Mẫu được pha loãng bằng nước cất 200 lần trước khi đem đo, nhiệt độ đo 25oC. Phân bố kích thước tiểu phân cũng được dùng để đánh giá hệ SLNs thông qua chỉ số đa phân tán (PDI), PDI càng gần bằng 0 thì chứng tỏ các tiểu phân trong hệ có kích thước càng đồng đều.

2.3.3. Phương pháp đánh giá gel chứa hệ tiểu phân nano vitamin E 2.3.3.1. Đánh giá sự giải phóng vitamin E từ gel