3.4.1.1. Mô tả
Cao có thể chất mềm dẻo, đồng nhất, màu nâu đen, mùi thơm, vị đắng. 3.4.1.2. Độ ẩm
Phương pháp thử: mất khối lượng do làm khô(1g, 110o
C, 3h) phụ lục 9.6 DĐVN IV.
Yêu cầu: độ ẩm không vượt quá 20%. 3.4.1.3. Định tính các nhóm chất hữu cơ
Phương pháp thử:
a. Định tính flavonoid
− Chiết xuất: hòa tan 0,5g cao đặc vào 10ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc (gấp nếp). Lắc ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml để loại tạp. Lấy lớp
nước, đem lắc với ethyl acetate, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào 10ml cồn 90ođược dịch chiết để làm phản ứng định tính.
− Định tính:
+ Phản ứng với dung dịch kiềm loãng:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt NaOH 10% lắc kỹ. Phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt.
+ Phản ứng với hơi NH3:
Tiến hành: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí khác nhau của giấy lọc, để khô, 1 vết che kín, 1 vết hơ trên miệng lọ chứa NH3 đặc. Phản ứng dương tính nếu có màu vàng, đỏ đến xanh lá.
+ Phản ứng với dung dịch FeCl3:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt FeCl3 5%, lắc đều. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.
+ Phản ứng Diazo hóa:
Tiến hành: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH, thêm 3 giọt thuốc thử diazo, lắc đều, đun nóng cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng, đỏ, đỏ cam.
b. Định tính saponin
− Chiết xuất: hòa tan 0,5g cao đặc vào 10ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc. Để nguội, lắc nhẹ với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml để loại tạp, lấy lớp nước, đun nóng nhẹ để loại hết ether dầu hỏa. Chiết với n-buthanol 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết n-buthanol lại, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn trong 10ml cồn 90o được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
− Định tính:
Tiến hành: lấy 5g cao đặc cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước, lắc mạnh trong vòng 5ph. Phản ứng dương tính nếu cột bọt bền vững sau 15ph.
+ Phản ứng Liebermann – Burchardt.
Tiến hành: lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml anhydric acetic, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. Phản ứng dương tính khi dẫn chất steroid cho màu xanh lá, dẫn chất triterpenoid cho màu đỏ.
+ Phản ứng Salkowski:
Tiến hành: lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi cắn, hòa tan cắn bằng 1ml chloroform, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. phản ứng dương tính nếu có màu vàng chuyển sang đỏ thẫm hay xanh hay xanh tím.
c. . Định tính alcaloid
− Chiết xuất: Lấy 5ml cao đặc hòa tan trong 20ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc. Thêm NH3 đặc đến pH 8-9. Lắc tiếp với chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml thu được dịch chiết chloroform. Cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 10ml H2SO4 1N được dịch chiết đem định tính.
Tiến hành: Lấy 3 ống nghiệm
Ống 1: 2ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử Mayer. Ống 2: 2ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử Dragendorff. Ống 3: 2ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử Bouchardat.
Phản ứng dương tính nếu ống 1 xuất hiện kết tủa trắng hoặc vàng, ống 2 xuất hiện tủa đỏ cam, ống 3 xuất hiện tủa nâu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
d. Định tính tanin
− Chiết xuất: Lấy 0,5g cao đặc, thêm 10ml nước cất, đun nóng cho tan. Lọc, dịch lọc làm phản ứng định tính.
• Phản ứng tạo tủa với muối kim loại:
o Phản ứng với FeCl3: lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa màu xanh đen. o Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm 5 giọt đồng acetate
10%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông.
o Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc rồi thêm 3-4 giọt chì acetat 10%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng.
• Phản ứng tạo tủa với gelatin: cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng.
e. Định tính Coumarin
− Chiết xuất: Cho 1g cao thêm 10ml nước, đun nóng cho tan, lọc vào bình gạn. lắc 3 lần với chloroform, mỗi lần 10ml. Lấy dịch chloroform, lắc dịch lọc 3 lần với NaOH 1N, mỗi lần 10ml. Gạn lấy phần nước, gộp dịch nước lại rồi acid hóa bằng HCl đậm đặc đến pH 3-4. Phần dịch nước này tiếp tục lắc với chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch chiết, rửa nhiều lần với nước cho đến pH trung tính. Lấy phần dịch chloroform, cô đến cắn. Cắn thu được hòa tan trong cồn 90o để làm các phản ứng hóa học.
− Định tính
+ Phản ứng đóng mở vòng lacton: cho vào 1 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống thứ 2 để nguyên. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát. Phản ứng dương tính khi. Ống 1 có tủa đục, ống 2 trong. Thêm cả 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều và quan sát. Ống 1 trong, ống 2 có tủa đục. Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đậm đặc lại trở nên đục như ống 2.
Phản ứng diazo hóa: Lấy 1ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1mk dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ, nhỏ vài giọt thuốc thử diazo thấy xuất hiện màu đỏ gạch (đỏ tươi, đỏ thẫm).
+ Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên 2 tờ giấy lọc khác nhau, nhỏ thêm lên đó dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ. Lấy 1 vết soi dưới đèn tử ngoại (366nm) trong vài phút, sau đó cho vết còn lại vào, thấy vết cho vào trước phát quang màu xanh lơ mạnh hơn vết cho vào sau. Tiếp tục chiếu thì vết cho vào sau sáng dần lên.
Yêu cầu: cao phải dương tính với các thuốc thử flavonoid, saponin, tanin, coumarin, alcaloid.
3.4.1.4. Đối chiếu dịch chiết vị thuốc và cao đặc trên SKLM
Yêu cầu: dịch chiết cao đặc phải có vết tương đồng với dịch chiết dược liệu.
− Bản mỏng silicagel GF 254 hoạt hóa ở 110o
C trong 1 giờ.
− Dịch chấm sắc ký: Lấy 1g cao đặc và lượng dược liệu có tương ứng trong 1g cao, cho vào bình nón có nắp đậy, thêm 10ml methanol, đun trên bếp cách thủy 10 phút, lọc vào bình định mức 10ml, thêm methanol đến vạch.
− Hệ dung môi khai triển:
+ Kim ngân đằng: Toluen – ethyl acetate – acid formic (4:7:1), soi dưới ánh sáng tử ngoại 366nm, dịch chiết cao phải có 2 vết có Rf tương đương với vết dịch chiết dược liệu.
+ Núc nác: Toluene –ethylacetat –acid formic (5:9:1,5), soi dưới ánh sáng tử ngoại 366nm, dịch chiết cao phải có 3 vết có Rf tương đương với vết dịch chiết dược liệu.
+ Hòe hoa: n- butanol- acid acetic- nước (4: 1: 5), soi dưới ánh sáng tử ngoại 254nm, dịch chiết cao phải có 4 vết có Rf tương đương với dịch chiết dược liệu trong đó có 1 vết trùng với vết rutin chuẩn.
+ Hoàng bá: chloroform –methanol (6:3,5), soi dưới ánh sáng tử ngoại 366nm, dịch chiết cao phải có 1 vết màu xanh sáng có Rf tương đương với dịch chiết dược liệu và vết berberin chuẩn.
3.4.1.5. Định lượng cắn tan trong ethyl acetat
Phương pháp thử: phương pháp cân.
Yêu cầu: hàm lượng cắn tan trong ethyl acetat không nhỏ hơn 7,13%. 3.4.1.6. Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang
− Tiến hành
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng20mg rutin chuẩn, cho vào bình định mức 10ml, hòa tan trong 7ml methanol (TT) bằng siêu âm. Để nguội, thêm methanol (TT) đủ 10ml. Lấy toàn bộ 10ml cho vào bình định mức 100ml, thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0,2mg rutin khan).
Xây dựng đường chuẩn: Lấy chính xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 và 6,0ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 25ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6ml ở mỗi bình rồi thêm 1ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1ml dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, lại để yên 10 phút.Thêm 10ml dung dịch NaOH 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500nm, vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch thử: Cân chính xác 5,000g cao đặc, thêm 50ml nước cất, đun nóng cách thủy cho tan, lọc vào bình gạn, để nguội. Lắc 3 lần với ether dầu hỏa, mỗi lần 15ml để loại tạp. Đun dịch chiết nước trên bếp cách thủy để loại hết
ether dầu hỏa. Cho vào bình gạn, để nguội, lắc 3 lần với ethyl acetat, mỗi lần 30ml trong 10 phút. Gộp toàn bộ dịch chiết vào cốc đã sấy khô, cân. Cô dịch chiết trên nồi cách thủy đến cắn. Cắn hòa tan trong 70ml methanol bằng siêu âm. Để nguội, cho vào bình định mức 100ml, thêm methanol tới vạch, lắc kỹ.Lấy 1ml dịch cho vào bình định mức 10ml, thêm nước tới vạch, lắc kỹ.Lấy chính xác 3ml cho vào bình định mức 25ml, thêm 3ml nước rồi thêm 1ml dung dịch natri nitrit 5% (TT) trộn kỹ.Để yên 6 phút, thêm 1ml nhôm nitrat 10% (TT), để yên 6 phút.Thêm 10ml dung dịch NaOH 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500nm.
Mẫu trắng: cho vào bình định mức 6ml nước cất rồi thêm 1ml dung dịch natri nitrit 5% (TT) trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1ml nhôm nitrat 10% (TT), để yên 6 phút.Thêm 10ml dung dịch NaOH 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút.
− Yêu cầu: hàm lượng rutin trong cao đặc chiết cồn tính trên cao khô tuyệt đối không nhỏ hơn 0,65%.
3.4.1.7. pH:
− Phương pháp thử: phụ lục 6.2 DĐVN IV
− Yêu cầu: pH dung dịch cao đặc pha loãng 1% nằm trong khoảng 4,0-4,5. 3.4.1.8. Độ tro toàn phần:
− Phương pháp thử: phụ lục 9.8 DĐVN IV.
− Yêu cầu: độ tro toàn phần cao đặc chiết cồn tính trên cao khô tuyệt đối không được quá 13,30%.