3.2.1.1. Định tính flavonoid
− Chiết xuất: hòa tan 0,5g cao đặc vào 10ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc (gấp nếp). Lắc ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml để loại tạp. Lấy lớp nước, đem lắc với ethyl acetate, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào 10ml cồn 90o được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
− Định tính:
+ Phản ứng với dung dịch kiềm loãng:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt NaOH 10% lắc kỹ. Phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Cao cồn và cao nước, màu vàng của dung dịch tăng lên nhiều. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với hơi NH3:
Tiến hành: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí khác nhau của giấy lọc, để khô, 1 vết che kín, 1 vết hơ trên miệng lọ chứa NH3 đặc. Phản ứng dương tính nếu có màu vàng, đỏ đến xanh lá.Tiến hành phép thử 1 lần.
Cao cồn:Vết hơ NH3 đặc có màu vàng đậm. Phản ứng dương tính.
Cao nước: Vết hơ NH3 đặc có màu vàng đậm. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với dung dịch FeCl3:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt FeCl3 5%, lắc đều. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả:
Cao cồn: Dung dịch có màu xanh đen. Phản ứng dương tính. Cao nước: Dung dịch có màu xanh đen. Phản ứng dương tính. + Phản ứng Diazo hóa:
Tiến hành: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH, thêm 3 giọt thuốc thử diazo, lắc đều, đun nóng cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng, đỏ, đỏ cam.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả:
Cao cồn: dung dịch xuất hiện màu đỏ cam. Phản ứng dương tính. Cao nước: dung dịch xuất hiện màu đỏ cam. Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Trong cao cồn và cao nước có chứa flavonoid.
3.2.1.2. Định tính saponin
− Chiết xuất: hòa tan 0,5g cao đặc vào 10ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc. Để nguội, lắc nhẹ với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml để loại tạp, lấy lớp nước, đun nóng nhẹ để loại hết ether dầu hỏa. Chiết với n- buthanol 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết n-buthanol lại, bốc hơi dung
môi đến cắn, hòa tan cắn trong 10ml cồn 90ođược dịch chiết để làm phản ứng định tính.
− Định tính:
+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Tiến hành: lấy 5g cao đặc cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước, lắc mạnh trong vòng 5ph. Phản ứng dương tính nếu cột bọt bền vững sau 15ph. Tiến hành phép thử 1 lần.
Kết quả:
Cao cồn: dương tính. Cao nước: dương tính.
+ Phản ứng Liebermann – Burchardt.
Tiến hành: lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml anhydric acetic, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. Phản ứng dương tính khi dẫn chất steroid cho màu xanh lá, dẫn chất triterpenoid cho màu đỏ.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả:
Cao cồn cho màu đỏ sẫm.Phản ứng dương tính. Cao nước có màu đỏ sẫm.Phản ứng dương tính. + Phản ứng Salkowski:
Tiến hành: lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi cắn, hòa tan cắn bằng 1ml chloroform, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. phản ứng dương tính nếu có màu vàng chuyển sang đỏ thẫm hay xanh hay xanh tím.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết luận:
Cao cồn: dung dịch có màu đỏ thẫm. Phản ứng dương tính. Cao nước: dung dịch có màu đỏ thẫm. Phản ứng dương tính. Nhận xét: trong cao cồn và cao nước có chứa saponin.
3.2.1.3. Định tính iridoid glycoside
− Chiết xuất: Hòa tan 0,5g cao đặc vào 10 ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan, lọc (gấp nếp). Lắc dịch lọc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml, lấy lớp nước, đun nóng để đuổi hết ether dầu hỏa. Lắc 3 lần với n-buthanol, mỗi lần 15ml. Gộp các dịch chiết n-buthanol, đem bốc hơi đến cắn. Hòa tan cắn trong 5ml methanol để làm phản ứng.
− Định tính:
+ Phản ứng Trim-Hill:
Pha thuốc thử Trim-Hill: cho vào bình nón 250ml 10ml CH3COOH, 1ml dung dịch CuSO4 0,2%, 0,5ml dung dịch HCl đặc. Lắc đều, đậy kín, pha trước khi dùng.
Tiến hành: cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml dung dịch thử. Thêm 2 giọt thuốc thử Trim-Hill vào ống 1, thêm 2 giọt nước cất vào ống 2, đun nhẹ 2 ống.Phản ứng dương tính nếu ống 1 đậm hơn ống 2.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Cao cồn và cao nước đều thấy màu vàng của ống 1 đậm hơn ống 2. Cao cồn cho kết quả rõ hơn cao nước.Phản ứng dương tính.
Nhận xét: trong cao cồn và cao nước đều có iridoid glycoside.
3.2.1.4. Định tính polysacharid
Chiết xuất: hòa tan 0,5g cao đặc trong 10ml nước nóng, lọc, để nguội, lấy dịch lọc làm thí nghiệm.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 4ml dịch lọc và 4 giọt thuốc thử Lugol, lắc đều. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.Tiến hành phép thử 3 lần.
Kết quả: Không thấy xuất hiện màu xanh đen. Phản ứng âm tính. Nhận xét: Trong cao cồn và cao nước không có polysacharid.
Chiết xuất: hòa tan 0,5g cao đặc trong 10ml nước nóng, lọc, để nguội, lấy dịch lọc làm thí nghiệm.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc trên và 1ml thuốc thử Feling A, 1ml thuốc thử Feling B, lắc đều, đun nóng cách thủy. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: mẫu cao cồn và cao nước đều cho kết tủa đỏ gạch. Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Cao cồn và cao nước đều có đường khử.
3.2.1.6. Định tính acid hữu cơ
Tiến hành: lấy 0,5g cao đặc, thêm 5ml nước khuấy đều, lọc. Thêm ít bột Na2CO3 lắc nhẹ.Phản ứng dương tính nếu xuất hiện bọt khí.
Kết quả: Mẫu cao cồn và cao nước đều xuất hiện bọt khí nhưng rất ít. Phản ứng dương tính.Tiến hành phép thử 3 lần.
Nhận xét: Cao cồn và cao nước đều có acid hữu cơ.
3.2.1.7. Định tính acid amin
Tiến hành: lấy 0,5g cao đặc hòa tan trong 10ml nước cất, đun nóng cho tan, lọc, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử nihydrin. Đun cách thủy trong 2-3 phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu tím.Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Mẫu cao cồn và cao nước đều xuất hiện màu tím. Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Cao cồn và cao nước đều có acid amin.
3.2.1.8. Định tính alcaloid
Chiết xuất: Lấy 5ml cao đặc hòa tan trong 20ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc. Thêm NH3 đặc đến pH 8-9. Lắc tiếp với chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml thu được dịch chiết chloroform. Cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 10ml H2SO4 1N được dịch chiết đem định tính.
Ống 1: 2ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử Mayer. Ống 2: 2ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử Dragendorff. Ống 3: 2ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử Bouchardat.
Phản ứng dương tính nếu ống 1 xuất hiện kết tủa trắng hoặc vàng, ống 2 xuất hiện tủa đỏ cam, ống 3 xuất hiện tủa nâu. Tiến hành phép thử 3 lần.
Kết quả: Mẫu cao cồn và cao nước ống 1 cho kết tủa vàng, ống 2 kết tủa đỏ cam, ống 3 xuất hiện tủa nâu. Để qua đêm thấy lượng tủa nhiều hơn.
Nhận xét: Cao cồn và cao nước đều chứa alkaloid.
3.2.1.9. Định tính tanin
− Chiết xuất: Lấy 0,5g cao đặc, thêm 10ml nước cất, đun nóng cho tan. Lọc, dịch lọc làm phản ứng định tính.
− Tiến hành
• Phản ứng tạo tủa với muối kim loại:
+ Phản ứng với FeCl3: lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa màu xanh đen. Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: mẫu cao cồn và cao nước đều xuất hiện tủa màu xanh đen. Phản ứng dương tính.
+ Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm 5 giọt đồng acetate 10%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông. Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: mẫu cao cồn và cao nước đều xuất hiện tủa bông màu hơi xanh. Phản ứng dương tính.
+ Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc rồi thêm 3-4 giọt chì acetat 10%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng. Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Mẫu cao cồn và cao nước đều cho tủa bông trắng. Phản ứng dương tính.
• Phản ứng tạo tủa với gelatin: cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng. Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Mẫu cao cồn và cao nước đều cho tủa bông trắng. Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Trong cao cồn và cao nước đều có chứa tanin.
3.2.1.10. Định tính coumarin
− Chiết xuất: Cho 1g cao thêm 10ml nước, đun nóng cho tan, lọc vào bình gạn. lắc 3 lần với chloroform, mỗi lần 10ml. Lấy dịch chloroform, lắc dịch lọc 3 lần với NaOH 1N, mỗi lần 10ml. Gạn lấy phần nước, gộp dịch nước lại rồi acid hóa bằng HCl đậm đặc đến pH 3-4. Phần dịch nước này tiếp tục lắc với chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch chiết, rửa nhiều lần với nước cho đến pH trung tính. Lấy phần dịch chloroform, cô đến cắn. Cắn thu được hòa tan trong cồn 90o để làm các phản ứng hóa học.
− Định tính
+ Phản ứng đóng mở vòng lacton: cho vào 1 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết. Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống thứ 2 để nguyên. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát. Phản ứng dương tính khi. Ống 1 có tủa đục, ống 2 trong. Thêm cả 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều và quan sát. Ống 1 trong, ống 2 có tủa đục. Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đậm đặc lại trở nên đục như ống 2. Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Cả cao cồn và cao nước phản ứng dương tính.
+ Phản ứng diazo hóa: Lấy 1ml dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ, nhỏ vài giọt thuốc thử diazo thấy xuất hiện màu đỏ gạch (đỏ tươi, đỏ thẫm). Tiến hành phép thử 2 lần.
Kết quả: Cả cao cồn và cao nước xuất hiện màu đỏ gạch. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên 2 tờ giấy lọc khác nhau, nhỏ thêm lên đó dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ. Lấy 1 vết soi dưới đèn tử ngoại (366nm) trong vài phút, sau đó cho vết còn lại vào, thấy vết cho vào trước phát quang màu xanh lơ mạnh hơn vết cho vào sau. Tiếp tục chiếu thì vết cho vào sau sáng dần lên. Tiến hành phép thử 1 lần.
Kết quả: Cả cao cồn và cao nước cho phản ứng dương tính. Nhận xét: trong cao cồn và cao nước đều chứa coumarin.
3.2.1.11. Định tính anthanoid
Phản ứng Borntraeger: Lấy 0,5g cao, hòa tan trong 10ml H2SO4 10%, đun nóng trên nồi cách thủy 10 phút, lọc vào bình gạn, để nguội. Lắc 3 lần với chloroform, mỗi lần 5ml. Lấy lớp chloroform làm phản ứng. Cho 2ml chloroform vào 2 ống nghiệm, ống 1 cho thêm 1ml NH4OH 10%, ống 2 cho thêm 1m NaOH 10%. Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu vàng.Tiến hành phép thử 3 lần.
Kết quả: Cả cao cồn và cao nước cho phản ứng âm tính. Nhận xét: Trong cao cồn và cao nước không chứa anthranoid.
3.2.1.12. Định tính chất béo
Lấy 1g cao đặc và 10ml nước, đun nóng để hòa tan, lọc vào bình gạn, để nguội. Lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết ether dầu hỏa lại, chia làm 2 ống nghiệm để làm các phản ứng định tính.
+ Phản ứng định tính chất béo: Nhỏ một giọt ether dầu hỏa lên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên. Xuất hiện vết mờ.
Kết quả: Cao cồn và cao nước cho kết quả âm tính.
STT Nhóm chất Phản ứng định tính
Kết quả Kết luận Kết quả Kết luận
1 Flavonoid
P/ư cyaniding P/ư với kiềm loãng P/ư với FeCl3 5% P/ư với hơi NH3
P/ư diazo hóa
+ + + + + có + + + + + có 2 Saponin Hiện tượng tạo bọt P/ư Salkowski P/ư Liebermann-Burchardt + + + có + + + có
3 Iridoid P/ư Trim-hill + có + có
4 Polysacharid P/ư với thuốc thử Lugol _ không _ không
5 Đường khử P/ư với TT Fehling + có + có
6 Acid hữu cơ P/ư với Na2CO3 + có + có
7 Acid amin P/ư với TT Ninhydrin + có + có
8 Alcaloid P/ư với TT Mayer P/ư với TT Dragendorff
+
+ có
+
9 Tanin P/ư với đồng acetat 10% P/ư với Chì acetat 10% P/ư với Gelatin 1%
+ + + có + + + có 10 Coumarin Đóng mở vòng lacton Tăng huỳnh quang Diazo + + + có + + + có
11 Anthranoid P/ư Borntraeger _ không _ không
12 Chất béo _ không _ không
Ghi chú: (+) Phản ứng dương tính (-) Phản ứng âm tính
Kết luận trong cao cồn và cao nước có chứa flavonoid, saponin, đường khử, iridoid, acid hữu cơ, alcaloid, tanin, coumarin, acid amin,không có polysacharid, anthranoid, chất béo. Các nhóm chất này đều có trong các vị thuốc như:
Flavonoid có trong kim ngân đằng, hòe hoa, núc nác, đơn lá đỏ. Saponin có trong kim ngân đằng.
Đường khử có trong đơn lá đỏ Iridoid có trong kim ngân đằng
Acid hữu cơ có trong kim ngân đằng, núc nác, thương nhĩ tử. Alkaloid có trong hoàng bá, núc nác.
Tanin có trong núc nác, đơn lá đỏ. Coumarin có trong kim ngân đằng. Acid amin có trong núc nác.