• Lấy máu làm xét nghiệm
Mỗi lần lấy 4 ml máu trong đó 2 ml chống đông bằng EDTA, 2 ml chống đông bằng heparin. Mẫu được chuyển về labo miễn dịch di truyền viện Huyết học và Truyền máu TW. Mỗi bệnh nhân được lấy máu 3 lần:
> Lần 1: trước phẫu thuật, sau khi có kết quả hội chẩn mổ và trước khi tiêm Aslem.
> Lần 2: sau phẫu thuật 7 ngày.
> Lần 3: cuối đợt truyền hóa chất thứ 6. • Nuôi cấy tế bào (điều kiện vô trùng)
> Máu chống đông bằng heparin (2ml) được để lắng trong 30 phút cho hồng cầu và huyết tương tách thành hai lớp. Hút lấy lớp huyết tương và lớp bạch cầu (nằm giữa lớp hồng cầu và lớp huyết tương) sang một ống nghiệm khác.
> Cho vào 2 ống nghiệm dung tích 10 ml (Grenier Bio-one) mỗi ống 6 ml dung dịch nuôi cấy TC 199; 0,3 ml huyết thanh AB và 6 - 8 giọt huyền dịch bạch cầu bệnh nhân.
> Ống chứng dương được thêm 0,1 ml PHA.
> ủ hai ống nghiệm trong điều kiện nhiệt độ
37°c,
nồng độ CO2 5% và độ ẩm thích họfp trong 48 giờ.• Thu hoạch tế bào và đếm chuyển dạng
> Ống nghiệm nuôi cấy tế bào được ly tâm với tốc độ 1 0 0 0 vòng/phút trong 5 phút sau đó thu lấy tế bào bạch cầu ở đáy ống.
> Trải tế bào thu hoạch được lên lam kính (để khô tự nhiên) và cố định bằng cồn 90° trong 2 0 phút.
> Nhuộm bằng giemsa trong 15 phút, rửa sạch, để khô tự nhiên.
> Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng dưới vật kính dầu. Tỷ lệ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trên 1 0 0 tế bào được đếm.
• Xác định các dưới nhóm lympho máu ngoại vi
> Số lượng tế bào CD3, CD4, CD8 được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang sử dụng máy đếm Pacscount. Kháng thể gắn chất phát quang sẽ kết hợp với dấu ấn kháng nguyên tương ứng trên bề mặt tế bào.
> Số lượng NK được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp sử dụng kit của Becton Dickinson với các bước chính như sau:
❖ 50 Ịil máu chống đông bằng EDTA được trộn đều với 5^1 kháng thể tương ứng anti CD56.
❖ Phá hồng cầu bằng 50 ụ,l dung dịch ly giải trong 8 phút
❖ Rửa sạch bằng dung dịch PBS 2 lần, mỗi lần ly tâm với tốc độ 2200 vòng/phút trong 5 phút.
❖ Cố định tế bào bằng 50 |nl dung dịch formol trong 30 phút
❖ Trải tế bào lên lam kính, đọc kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang ở Ằ=490 nm, vật kính 40. Tế bào dương tính là những tế bào bắt màu xanh lục.
