1.4.1 Nguồn gốc của Aslem
© ©
CINH3— CH—C— HN
lĩ
0
Hình 5. Công thức câu tao của Aslem
Aslem là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu đã được sử dụng trên lâm sàng ung thư từ hơn 30 năm nay. Bắt nguồn từ Funtumin, một amino Steroid được Khương Hữu Quý (1958) chiết tách và phân lập từ lá cây Funtumia latifolia
Stapf Apocỵnaceae (Đông Phi), Nguyễn Đăng Tâm và cộng sự (1965, Viện nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên ở Gif-Sur-Yvette, Pháp) đã bán tổng hợp một dẫy aminoacyl steroid, trong đó Glycyl Funtumin (GF) dưới dạng hydrobromid (LHl) là dẫn xuất có tác dụng kích thích miễn dịch mạnh. Năm 1977, tại Việt Nam, Đặng
Hanh Phức và cs đã bán tổng hợp thành công Glycyl Funtumin dưới dạng muối hydroclorid và đặt tên là Aslem [12]. Từ năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóa của trường Đại học tổng hợp Leiden (Hà Lan), Aslem đã được tổng hợp toàn phần tại bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội.
Hiện nay, chế phẩm Aslem đã được Cục QLDVN cấp số đăng ký lưu hành trên thị trường Việt Nam và được BYT đưa vào danh mục thuốc thiết yếu sử dụng tại các cơ sở khám chữa bệnh trong toàn quốc. Năm 2004, Bộ KH và CN đã cấp kinh phí hỗ trợ cho đề tài Aslem phát triển thành dự án cấp Nhà nước nhằm nâng cao chất lượng của thuốc, đồng thời đáp ứng được nhu cầu sử dụng thuốc trong cả nước [5].
1.4.2. Tác dụng dược lý và các nghiên cứu tiền lâm sàng
• Tác dụng kích thích miễn dịch của Aslem
Năm 1973, Gs Tôn Thất Tùng và cs đã sử dụng GF lần đầu tiên để điều trị bổ trợ cho bệnh nhân ung thư gan nguyên phát tại bệnh viện Việt Đức. Kể từ đó, GF được tiếp tục nghiên cứu về độc tính dược lý, cơ chế tác dụng, tác dụng phụ...Hiện nay thuốc đang được sử dụng thường xuyên trong điều trị bổ trợ ung thư đường tiêu hóa, ung thư phổi và ung thư vú.
Tác dụng kích thích miễn dịch của GF đã được khẳng định thông qua một loạt các thử nghiệm sinh học tiến hành ở trong và ngoài nước. Trên test phục hồi tạo Rosette E bị ức chế bởi theophyllin, mẫu thử có GF cho tỷ lệ tế bào tạo hoa hồng là 47,7% so sánh với tỷ lệ tương ứng ở mẫu chứng không có GF là 17,3% và ở mẫu
chuẩn không bị ức chế là 48,5%. Tác dụng kích thích ĐƯMD của Aslem cũng được chứng minh thông qua khả năng hoạt hóa đại thực bào, phản ứng tạo quầng dung huyết (thử nghiệm Jerne Cunningham) [6], [10].
Trên tế bào ung thư gan nuôi cấy (cultured hepatoma cell) nghiên cứu của Giesen và Beck (1981) đã chỉ ra rằng; ở nồng độ 6 Ịig/ml môi trưòỉng nuôi cấy, GF có khả năng tiêu diệt 50% tế bào sau 3 ngày tiếp xúc và khi nồng độ GF tăng lên 30
Ịig/ml thì 100% tế bào bị tiêu diệt sau 3 ngày tiếp xúc [56].
Nghiên cứu ảnh hưởng của Aslem lên khả năng chuyển dạng lympho máu ngoại vi bệnh nhân ung thư ĐTT, nhóm tác giả Nguyễn Tiến Thành và cs đã nhận
thấy: Aslem kích thích chuyển dạng lympho hiệu quả nhất ở mức liều từ 0,15-0,5
)Lig/ml, với liều 0,15 |J.g/ml thuốc làm tăng đáp ứng chuyển dạng (ĐƯCD) từ 21,6%
lên 33,6% (p = 0,05), gần tương đương với ĐƯCD lympho ở người khỏe mạnh khi có mặt Aslem (36,3%). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Phạm Hoàng Phiệt và cs về ĐƯCD lympho trên người tình nguyện khỏe mạnh: GF không làm thay đổi
đáng kể ĐƯCD lympho ở mức liều 2-20 Ịig/ml, ngược lại ở mức liều cao hơn (90
|ag/ml) GF còn thể hiện tác dụng gây độc tế bào lympho T. Cũng trong nghiên cứu của Nguyễn Tiến Thành và cs, As lem có xu hưófng làm tăng chế tiết các cytokin nhóm 1 như IL-2 và IFN-y trong khi làm giảm chế tiết các cytokin nhóm 2 như IL-4 và IL-10 [11], [14]. Gần đây, sử dụng kỹ thuật mô học thường quy và kỹ thuật hóa mô miễn dịch, nghiên cứu Lê Quý Toản và cs đã cho thấy: phác đồ điều trị bổ trợ bằng Aslem có xu hướng làm tăng thâm nhiễm lympho T vào mô ung thư dạ dày và ĐTT, đặc biệt ỏ những bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn (Dukes C) [15].
• Dược động học
Các đặc điểm về dược động học của Aslem đã bước đầu được nghiên cứu. Ị
ứng dụng LC-MS để khảo sát dược động học của GF trên chó thực nghiệm, Phạm Như Quỳnh và cs đã thu được những thông số như sau: Tn,ax = 12,25 h; =0,16 lag/ml; Ti/2= 3,5 h [13],
• Tác dụng phụ và độc tính
Cho tới nay, sử dụng Aslem ở liều điều trị chưa thấy có tác dụng phụ nguy hiểm nào được ghi nhận. Một số biểu hiện mẫn cảm như nôn, buồn nôn, mẩn ngứa và táo bón có gặp nhưng rất hiếm.
Kết quả thu được từ các nghiên cứu về độc tính cấp và bán cấp trên động vật thí nghiệm cho thấy Aslem có độ an toàn rất cao, liều LDjo (72 mg/kg) của thuốc lớn gấp 12000 lần liều điều trị. v ề khả năng gây đột biến của Aslem, nghiên cứu trên chuột với mức liều gấp 1000 lần liều điều trị đã không thấy có sự biến đổi về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể của tế bào tủy xương và tinh hoàn. Ngoài ra, thuốc không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, huyết áp cũng như chức năng tạo máu và sinh sản trong các nghiên cứu trên chuột [7], [8].
1.4.3. Những thử nghiệm lâm sàng
Trên lâm sàng ung thư, Aslem đã được sử dụng từ hơn 30 năm nay và cho những kết quả rất đáng khích lệ. Tôn Thất Tùng và cs (1975) đã nghiên cứu tác dụng của Aslem trong điều trị bổ trợ ung thư gan nguyên phát tại bệnh viện Việt Đức (Hà nội). Trong số 134 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, 28 bệnh nhân được thắt động mạch gan và tiêm bắp LHl (0,3mg/ml/tuần) (A), 10 bệnh nhân được phẫu thuật cắt gan và tiêm LHl (B), 27 bệnh nhân chỉ tiêm LHl mà không can thiệp một liệu pháp nào khác (C) và 69 bệnh nhân chỉ điều trị bằng những thuốc thông thường, không đặc hiệu (D). Những kết quả thu được cho thấy LHl làm tăng đáng kể thời gian sống thêm sau mổ của bệnh nhân [63].
Bảng 7. Kết quả nghiên cứu trên ung thư gan tai bệnh viện Việt Đức
Thời gian sống (tháng) P Nhóm thắt động mạch gan (A) 3,8 <0,001 Nhóm cát bỏ gan (B) 4,6 0,0001 Nhóm chỉ tiêm LHl (C) 3,7 <0,05 Nhóm chứng (D) 0,7 (Theo Tôn Thất Tùng - 1975 [63])
Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Anh và cs tổng kết hiệu quả sử dụng Aslem trong điều trị bổ trợ ung thư gan giai đoạn 1991 - 2000 tại khoa tiêu hóa bệnh viện Việt Đức cho thấy: Aslem làm cải thiện rõ rệt thời gian sống thêm sau mổ của bệnh nhân, thể hiện rõ nhất ở nhóm bệnh nhân cắt gan có kết hợp tiêm Aslem vào khối u. Cụ thể: thời gian sống thêm trung bình sau mổ của 34 bệnh nhân cắt gan có tiêm Aslem vào khối u là 18±4 tháng trong khi 45 bệnh nhân cắt gan không tiêm Aslem vào khối u có thời gian sống thêm trung bình chỉ là 7±1 tháng (p = 0,034) [1].
Thử nghiệm Aslem tiến hành trên 26 bệnh nhân ung thư vùng tâm vị tại Bệnh viện Việt Đức từ tháng 3 năm 2000 đến tháng 10 năm 2001 (Nguyễn Hoàng Anh và cs) đã cho những kết quả khả quan. Tỷ lệ sống sau 12 tháng ở nhóm bệnh nhân được phẫu thuật + Aslem là 60,6%, trong khi ở nhóm phẫu thuật đơn thuần là 33,3% [2].
Trong điều trị ung thư phế quản nguyên phát, Hoàng Đình Cầu và cs đã sử dụng kết hợp Aslem, tam thất và vitamin c liều cao với mục đích điều trị bổ trợ sau
phẫu thuật. Kết quả theo dõi trên 8 8 bệnh nhân (Viện Lao và Bệnh phổi trung ương) cho thấy, thời gian sống thêm sau mổ 6 tháng, 12 tháng, 24 tháng ở nhóm 31 bệnh nhân dùng Aslem cao hơn rõ rệt so với nhóm 47 bệnh nhân chỉ phẫu thuật đơn thuần [4]. Kết quả theo dõi xa với 10 bệnh nhân nhóm điều trị miễn dịch và 20 bệnh nhân nhóm không điều trị miễn dịch được trình bày trong (Bảng 8).
Bảng 8. Kết quả theo dõi xa tác dụng của Aslem trên ung thư p h ế quản
Nhóm dùng Aslem Nhóm chứng p
Tỷ lệ sống sau 3 năm (%) 70 (7/10) 33 (6/20) 0,056
Tỷ lệ sống sau 4 năm (%) 60 (6/10) 20 (4/20) 0,045
(Theo Hoàng Đình Cầu -1986 [4])
Tôn Đức Lang và cs (1979) cũng đã sử dụng phối hợp Aslem (tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu) cùng kháng sinh trong điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng ngoại khoa. Kết quả Aslem làm tăng sức đề kháng của cơ thể vói vi khuẩn thể hiện qua số lượng bạch cầu tăng từ 160 đến 2 0 0%, làm giảm liều lượng kháng sinh cần dùng so với liều thông thường và rút ngắn thời gian điều trị [9],
Những kết quả đáng khích lệ trên in vitro cũng như trên in vivo là cơ sở quan trọng để chúng tôi mạnh dạn tiến hành thử nghiệm lâm sàng tiến cứu, phân nhóm ngẫu nhiên nhằm đánh giá một cách đầy đủ và chính xác tác dụng bổ trợ của Aslem trong điều trị ung thư đại trực tràng.
PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành trên các bệnh nhân ung thư đại trực tràng được chẩn đoán và điều trị tại khoa Phẫu thuật tiêu hóa, bệnh viện Hữu nghị Việt Đức.
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn
• Bệnh nhân dưới 70 tuổi
• Chẩn đoán ung thư đại trực tràng: thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng (X quang, nội soi sinh thiết đại tràng, chất chỉ điểm khối u như CEA, CA_199) • Các xét nghiệm huyết học, sinh hóa gan, thận, protein huyết tương đều ở giới hạn bình thường
• Phẫu thuật mang tính chất triệt căn
• Giải phẫu bệnh sau mổ khẳng định là ung thư biểu mô tuyến (Adenocarcinoma) Dukes B-C.
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ
• Bệnh nhân trên 70 tuổi
• Không chấp nhận tham gia nghiên cứu
• Được điều trị hóa chất hoặc tia xạ vùng trước phẫu thuật
• Mắc kèm theo các bệnh lý mạn tính nặng như AIDS, lao, viêm gan B... • Không được điều trị phẫu thuật hay phẫu thuật không triệt căn
• Kết quả giải phẫu bệnh không phải là Adenocarcinoma Dukes B-C
• Bệnh nhân không theo đúng phác đồ điều trị (bỏ điều trị hóa chất, miễn dịch...)
2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kê nghiên cứu
Nghiên cứu tiến cứu, thử nghiệm lâm sàng có đối chứng, phân nhóm ngẫu nhiên theo phưoỉng pháp mù đơn.
2.2.2 Các bước lựa chọn bệnh nhân
• Bệnh nhân khi nhập viện sẽ được ghi nhận các thông tin về dịch tễ (tuổi, giới, tiền sử bản thân, gia đình), các đặc điểm về lâm sàng, các xét nghiệm cận lâm sàng
thường quy (huyết học, sinh hóa máu, nước tiểu), các chẩn đoán hình ảnh (X quang khung đại tràng, soi hậu môn trực tràng, siêu âm, nội soi).
• Những bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu sẽ được giải thích về mục tiêu nghiên cứu, quyền lợi và nghĩa vụ khi tham gia nghiên cứu. Nếu bệnh nhân đồng ý sẽ viết đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu.
• Dựa vào bảng số ngẫu nhiên chia bệnh nhân thành hai nhóm; nhóm điều trị FUFOL + Aslem (nhóm A, dự kiến 60 bệnh nhân) và nhóm điều trị FƯFOL (nhóm B, dự kiến 60 bệnh nhân).
2.2.3 Phác đồ điều trị• Trước phẫu thuật • Trước phẫu thuật
> Nhóm A: tiêm liên tục Aslem từ khi có kết quả hội chẩn đến ngày trước phẫu thuật. Tiêm bắp 1 ống 0,3 mg/ngày (trước phẫu thuật ít nhất 24 giờ).
> Nhóm B: điều trị và theo dõi như thường quy tại bệnh phòng.
• Sau phẫu thuật
> Ghi nhận đánh giá của phẫu thuật viên về đặc điểm, cách thức phẫu thuật và mô tả đại thể tổn thương. Ghi nhận kết quả giải phẫu bệnh: loại ung thư, số hạch và phân loại ung thư theo Dukes.
> Cả hai nhóm: truyền tổng cộng 6 đợt hóa chất (mỗi đợt kéo dài 5 ngày), hai đợt liên tiếp cách nhau 21 ngày. Mỗi ngày truyền 5-FU 400-600 mg/m^ da và 20-200 mg/m^ da acid íolinic. Đợt 1 bắt đầu trong vòng 30 ngày sau mổ.
> Nhóm A: sau phẫu thuật về bệnh phòng tiêm liên tục 1 ống Aslem 0,3 mg/48 giờ. Từ khi ra viện cho đến hết 6 đợt truyền hóa chất: tiêm bắp 1 ống Aslem 0,3 mg/lần, mỗi tuần dùng 2 lần.
2.2.4 Miễn dịch máu ngoại vi
• Lấy máu làm xét nghiệm
Mỗi lần lấy 4 ml máu trong đó 2 ml chống đông bằng EDTA, 2 ml chống đông bằng heparin. Mẫu được chuyển về labo miễn dịch di truyền viện Huyết học và Truyền máu TW. Mỗi bệnh nhân được lấy máu 3 lần:
> Lần 1: trước phẫu thuật, sau khi có kết quả hội chẩn mổ và trước khi tiêm Aslem.
> Lần 2: sau phẫu thuật 7 ngày.
> Lần 3: cuối đợt truyền hóa chất thứ 6. • Nuôi cấy tế bào (điều kiện vô trùng)
> Máu chống đông bằng heparin (2ml) được để lắng trong 30 phút cho hồng cầu và huyết tương tách thành hai lớp. Hút lấy lớp huyết tương và lớp bạch cầu (nằm giữa lớp hồng cầu và lớp huyết tương) sang một ống nghiệm khác.
> Cho vào 2 ống nghiệm dung tích 10 ml (Grenier Bio-one) mỗi ống 6 ml dung dịch nuôi cấy TC 199; 0,3 ml huyết thanh AB và 6 - 8 giọt huyền dịch bạch cầu bệnh nhân.
> Ống chứng dương được thêm 0,1 ml PHA.
> ủ hai ống nghiệm trong điều kiện nhiệt độ 37°c, nồng độ CO2 5% và độ ẩm thích họfp trong 48 giờ.
• Thu hoạch tế bào và đếm chuyển dạng
> Ống nghiệm nuôi cấy tế bào được ly tâm với tốc độ 1 0 0 0 vòng/phút trong 5 phút sau đó thu lấy tế bào bạch cầu ở đáy ống.
> Trải tế bào thu hoạch được lên lam kính (để khô tự nhiên) và cố định bằng cồn 90° trong 2 0 phút.
> Nhuộm bằng giemsa trong 15 phút, rửa sạch, để khô tự nhiên.
> Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng dưới vật kính dầu. Tỷ lệ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trên 1 0 0 tế bào được đếm.
• Xác định các dưới nhóm lympho máu ngoại vi
> Số lượng tế bào CD3, CD4, CD8 được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang sử dụng máy đếm Pacscount. Kháng thể gắn chất phát quang sẽ kết hợp với dấu ấn kháng nguyên tương ứng trên bề mặt tế bào.
> Số lượng NK được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp sử dụng kit của Becton Dickinson với các bước chính như sau:
❖ 50 Ịil máu chống đông bằng EDTA được trộn đều với 5^1 kháng thể tương ứng anti CD56.
❖ Phá hồng cầu bằng 50 ụ,l dung dịch ly giải trong 8 phút
❖ Rửa sạch bằng dung dịch PBS 2 lần, mỗi lần ly tâm với tốc độ 2200 vòng/phút trong 5 phút.
❖ Cố định tế bào bằng 50 |nl dung dịch formol trong 30 phút
❖ Trải tế bào lên lam kính, đọc kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang ở Ằ=490 nm, vật kính 40. Tế bào dương tính là những tế bào bắt màu xanh lục.
2.2.5 Miễn dịch tại mô ung thư
• Bệnh phẩm mô ung thư gồm tiêu bản giải phẫu bệnh (GPB) và block parafin được chuyển tới khoa GPB bệnh viện Việt Đức và khoa GPB bệnh viện K.
• Xác định mức độ thâm nhiễm lympho trên tiêu bản nhuộm HE mô ung thư theo tiêu chuẩn của Jass, được bổ sung bởi Adam và cs [18], Kết quả được đọc độc lập bởi 2 nhóm bác sĩ GPB (Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện K).
• Xác định mức độ thâm nhiễm dưới nhóm lympho T (CD3, CD4, CD8, CD56) tại mô ung thư trên tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) tiến hành theo phương pháp nhuộm gián tiếp với kỹ thuật khuyếch đại nhờ phức hợp avidin-biotin (tại khoa GPB bệnh viện K) (Hình 7). Quy trình xác định mỗi dưới nhóm lympho T gồm các bước chính như sau:
> Bệnh phẩm được cắt dày 4 ịim được loại parafin bằng toluen và cồn như nhuộm mô học thông thường
> Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch citrat 0,01 mol/L, pH 6 hoặc EDTA pH 9, đun sôi trong 5 phút.
> ủ lần lượt với kháng thể thứ nhất trong 1 giờ và kháng thể thứ hai trong 30 phút.
> ủ tiếp tục với ABC (Avidin-Biotin Complex) trong 30 phút và DAB (3,3- diaminobenzidin) trong 1 0 phút.
> Nhuộm nhân với hematoxylin eosin trong 30 giây
f 'ö ch ỉit
Hình 6. Nguyên tắc phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
1. Dấu ấn kháng nguyên (CD) 5. Streptavidin 2. Kháng thể thứ nhất 6. Men oxy hóa