Phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học có vai trò quan trọng trong việc có thể đánh giá đúng các số liệu về dược động học, đánh giá và phân tích các số liệu trong nghiên cứu SKD và TĐSH. Các phương pháp này cần phải được đánh giá và thẩm định để đảm bảo kết quả thu được khi phân tích bằng phương pháp đó là chính xác, ổn định và đáng tin cậy.
LPZ có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như
UV- VIS [21], [22] , phương pháp cực phổ [12], các phương pháp sắc ký... Để định lượng LPZ trong huyết tương, phương pháp phù hợp nhất là HPLC, có nhiều công trình đã công bố sử dụng phương pháp HPLC để định lượng LPZ trong huyết tương. Để phát hiện LPZ sau khi qua hệ thống sắc ký có thể dùng detector khối phổ [10], [32], [38] và detector quang phổ tử ngoại [9], [14], [27], với detector khối phổ độ nhạy cao tuy nhiên hiện chưa được dùng rộng rãi trong nước vì đầu tư lớn và cần nhiều điều kiện đảm bảo đi kèm (hệ thống nguồn cấp điện, nguồn cấp chân không...), đề tài trên đã sử dụng detector UV là phương pháp đơn giản, vẫn đảm bảo được độ nhạy (giới hạn định lượng) và phù hợp với điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm.
Phương pháp đã xây dựng được thẩm định trên đầy đủ các tiêu chí trong việc đánh giá và thẩm định phương pháp phân tích theo yêu cầu của FDA gồm: Tính đặc hiệu, chọn lọc; khoảng tuyến tính; độ đúng và độ lặp lại; giới hạn định lượng; hiệu suất chiết; độ ổn định của LPZ trong dung dịch chuẩn gốc và trong huyết tương.
- Lựa chọn chuẩn nội: Đối với phương pháp phân tích trong dịch sinh học, chuẩn nội đóng vai trò là yếu tố quan trọng. Chuẩn nội có tính chất lý hoá gần giống với chất phân tích, được cho vào cùng với chất phân tích để
61
hoá gần giống nhau, do vậy có thể sử dụng một trong các chất PPIs để định lượng các chất còn lại. Phương pháp trên dùng PPZ là một chất chuẩn dễ
kiếm, có cực đại hấp thụ gần với cực đại hấp thụ của LPZ làm chuẩn nội, lựa chọn này cũng phù hợp với nhiều phương pháp đã được công bố [20], [27], [36]. Ngoài các PPIs một số tác giả đã sử dụng chuẩn nội là những chất khác tuy nhiên các chất này đều khó kiếm [9], [13], [14], [28].
- Điều kiện sắc ký và tính đặc hiệu, chọn lọc: Các pha động với các tỷ
lệ khác nhau được khảo sát để tìm ra điều kiện sắc ký phù hợp dựa trên các thông số của pic sắc ký và độ ổn định của chất phân tích trong pha động. LPZ là chất kém bền, đặc biệt là trong môi trường có pH thấp do vậy pha động cần phải có pH phù hợp để LPZ ít bị phân huỷ nhưng vẫn đảm bảo tốt các thông số của pic sắc ký. Một số tác giả sử dụng pH của đệm là 3,0 là chưa hợp lý [23], nhưng chủ yếu các tác giả sử dụng pH của đệm là khoảng 7,0 [15], [19], [35] . Phương pháp đã xây dựng trên sử dụng dung dịch đệm đơn giản, dễ
kiếm, pH của đệm là 8,0 là hợp lý, ở pH này đảm bảo cho chất phân tích LPZ
ổn định trong quá trình phân tích và các thông số của pic sắc ký thu được: Số đĩa lý thuyết, hệ số phân giải, hệ số bất đối xứng đảm bảo tốt theo yêu cầu. Tính chọn lọc của phương pháp được xác định bằng cách so sánh tại vị
trí tương ứng với các pic cần quan tâm trên sắc ký đồ của các mẫu chuẩn và mẫu trắng. Phương pháp đảm bảo được có khả năng phát hiện ra LPZ trên một nền mẫu phức tạp là mẫu huyết tương.
- Khoảng tuyến tính: Đề tài đã xây dựng khoảng tuyến tính gồm 8 điểm bao gồm cả giới hạn định lượng (LLOQ) có nồng độ trong huyết tương từ
0,05 µg/ml đến 3,0 µg/ml, điều này phù hợp theo khuyến cáo của FDA [17], phù hợp với các nghiên cứu trước đây [13], [27]. Khoảng nồng độ đã xây dựng phù hợp với nồng độ thực tế của LPZ trong huyết tương chó khi cho uống một liều đơn LPZ 30 mg (nồng độ cao nhất của Cmax xác định được là khoảng 1,7 µg/ml, nằm trong khoảng nồng độ đã xây dựng). Hệ số tương
62
quan hồi qui giữa đáp ứng phân tích và nồng độ LPZ trong huyết tương xấp xỉ
1 (0,9999) và có 100% số điểm có độ đúng tính lại nằm trong khoảng từ 85%- 115%, như vậy phương pháp phân tích đạt yêu cầu vềđộ tuyến tính.
- Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp được tiến hành bằng cách thêm chuẩn vào các mẫu huyết tương trắng, độ đúng và độ lặp lại được tiến hành trên 3 lô mẫu có nồng độ khác nhau là 0,2 µg/ml (điểm gần với giới hạn
định lượng), 1,5 µg/ml (điểm giữa của đường chuẩn) và 2,5 µg/ml (điểm gần với điểm trên của đường chuẩn), với 6 mẫu cho mỗi điểm, cách tiến hành này phù hợp với hướng dẫn của DĐVN IV [3]. Kết quả, phương pháp có độ đúng cao (lần lượt là 97,50%, 101,52% và 101,68% đối với độ đúng trong ngày và 98,40%, 99,54% và 99,98% đối với độ đúng giữa các ngày). Độ lặp lại có các RSD% cao nhất là 5,96%, các kết quả này đáp ứng được yêu cầu của phân tích thuốc trong dịch sinh học (độ đúng từ 85%- 115% và độ lặp lại nhỏ hơn 15%). Như vậy, phương pháp có khả năng xác định được chính xác và đáng tin cậy nồng độ LPZ trong huyết tương.
- Giới hạn định lượng (LLOQ): LLOQ của phương pháp được xác định bằng xác định độ đúng, độ lặp lại và pic thu được trên sắc đồ của mẫu có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn là 0,05 µg/ml. Kết quả cho thấy nồng độ
0,05 µg/ml đáp ứng được là LLOQ của phương pháp với độ đúng và độ lặp lại chấp nhận được (độ đúng là 94,29% và độ lặp lại là 17,14%). Với nồng độ
Cmax của LPZ trong huyết tương chó khoảng 1 µg/ml thì giá trị LLOQ trên là phù hợp (LLOQ bằng 1/20 Cmax). Giá trị LLOQ của phương pháp xây dựng cũng tương đương với các nghiên cứu đã được công bố [9], [14], [27].
- Phương pháp xử lý mẫu và hiệu suất chiết: Đề tài đã tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu huyết tương khác nhau gồm tủa protein và chiết lỏng- lỏng. Với phương pháp tủa protein, tuy là phương pháp tiến hành
đơn giản, ít tốn kém nhưng mẫu sau khi được xử lý thường chưa sạch, do vậy dễ gây bẩn cột, làm giảm tuổi thọ của cột.
63
Hỗn hợp diethyl ether- dicloromethan có khả năng hoà tan tốt LPZ và PPZ, có nhiệt độ sôi thấp do vậy thuận lợi cho việc bốc hơi dung môi để làm giàu mẫu, nên có một số công trình đã chọn hỗn hợp trên với một vài tỷ lệ
khác nhau làm dung môi chiết [20], [28], [37]. Thực tế khi tiến hành chiết lỏng- lỏng bằng hỗn hợp diethyl ether- dicloromethan (70: 30) thì trên sắc ký
đồ tại các vị trí gần với pic của LPZ và PPZ có xuất hiện một vài pic tạp nên
ảnh hưởng đến tính kết quả mặc dù hiệu suất chiết của phương pháp đảm bảo
đạt theo yêu cầu, vì vậy đề tài đã không lựa chọn phương pháp chiết này cho
các nghiên cứu tiếp theo.
Tert- butyl methyl ether (TBME) là dung môi có khả năng hoà tan tốt LPZ và PPZ, có nhiệt độ sôi thấp (55,20C) nên rất dễ làm bay hơi hết dung môi để làm giàu mẫu. Kết quả khi chiết bằng TBME cho thấy, mẫu huyết tương được xử lý khá sạch, đường nền trên sắc ký đồ phẳng do vậy ít làm giảm tuổi thọ của cột phân tích. Hiệu suất chiết bằng TBME của chất phân tích LPZ và chuẩn nội PPZ cao và ổn định (với LPZ hiệu suất chiết từ 97,67%
đến 101,02% với RSD% cao nhất là 5,02%; với PPZ hiệu suất chiết là 96,35%).
Với phương pháp chiết LPZ đã xây dựng chỉ cần dùng một lượng dung môi ít (2 ml) do vậy tiết kiệm được dung môi, thân thiện hơn đối với môi trường. Lượng mẫu cần dùng ít (chỉ 500 µl huyết tương cho một lần phân tích) nên thuận lợi và tiết kiệm trong công tác lấy mẫu, bảo quản mẫu. Mẫu huyết tương sau khi chiết, được bốc hơi trên máy cô quay chân không ở nhiệt
độ thấp (300C) nên ít làm ảnh hưởng đến chất phân tích, máy có thể cô cùng lúc được nhiều mẫu và thời gian cô cạn ngắn (khoảng 1,5 giờ), dung môi sau khi bốc hơi được thu hồi nên tiết kiệm thời gian và thân thiện hơn với môi trường. Một số tác giả cũng đã sử dụng TBME làm dung môi chiết tuy nhiên lượng dung môi cần dùng nhiều hơn (4ml và 6ml) [13], [14], [27].
64
- Độổn định của LPZ: LPZ là chất kém bền đối với các tác nhân từ môi trường, đặc biệt là nhiệt độ do vậy độ ổn định của chất phân tích có vai trò quan trọng hơn đối với LPZ. Độổn định của LPZ trong dung dịch chuẩn gốc và trong huyết tương đã được khảo sát. Kết quả cho thấy trong dung dịch chuẩn gốc, khi bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (nhiệt độ từ 20C- 80C) trong 5 ngày thì sự sai khác về nồng độ so với thời điểm ban đầu lớn nhất là -1,30%, trong huyết tương với các điều kiện bảo quản đã khảo sát thì sự sai khác so với nồng độ ban đầu cao nhất là -2,89%. Như vậy, sau thời gian bảo quản, các dung dịch và mẫu chứa LPZ đều bị giảm hàm lượng tuy nhiên sai khác này có thể chấp nhận được (nhỏ hơn 5%).
Nhận xét chung về phương pháp phân tích: Phương pháp định lượng LPZ trong huyết tương đã được xây dựng ở trên đáp ứng được yêu cầu về
phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn của FDA và DĐVN IV. Phương pháp có thể ứng dụng để nghiên cứu SKD và TĐSH của LPZ trên chó.
