Một số mẫu huyết tương chó được cho uống LPZ với liều đơn 30 mg
đã được định lượng bằng phương pháp trên. Sắc ký đồ được thể hiện trong hình 3.19.
50 M in u te s 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 Vo lts -0 .0 2 0 .0 0 0 .0 2 Pant o pr az ol 424932 Lansoprazol 67415
Hình 3. 19: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó uống LPZ
Kết quả cho thấy pic LPZ trong mẫu định lượng được cân đối, sắc nét và riêng biệt. Dựa vào đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện, xác định
được nồng độ LPZ trong mẫu huyết tương trên là 0,47 µg/ml.
Nhận xét chung về phương pháp phân tích: Từ các kết quả thẩm
định phương pháp định lượng LPZ trong huyết tương thu được ở trên, thấy rằng phương pháp đã xây dựng phù hợp để định lượng LPZ trong huyết tương chó, có thể áp dụng phương pháp để nghiên cứu SKD và TĐSH của LPZ trên chó.
3.4. NGHIÊN CỨU SKD CỦA VIÊN NANG LPZ 30 mg TRÊN CHÓ 3.4.1. Phân tích mẫu huyết tương chó được uống LPZ
Tiến hành thực nghiệm và lấy mẫu huyết tương tại các thời điểm theo thiết kế nghiên cứu như mô tả trong mục 2.2.5. Các mẫu huyết tương sau khi lấy, được bảo quản ở - 450C đến khi phân tích. Tiến hành phân tích các mẫu huyết tương trên theo phương pháp đã xây dựng, xác định nồng độ của LPZ trong huyết tương bằng đường chuẩn xây dựng trong cùng điều kiện. Kết quả
nồng độ LPZ trong huyết tương chó được uống thuốc thử và thuốc đối chiếu
51
Bảng 3. 12: Nồng độ LPZ (ng/ml) trong huyết tương chó sau khi uống viên đối chiếu
Thời gian (giờ)
Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 Con 6 Con 7 Con 8 Con 9 Con 10 Con 11 Con 12 TB
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 - - - - - 65,13 - - - - 130,96 180,06 - 1,0 54,57 - - 50,26 75,21 201,26 - - - - 267,34 363,98 87,18 1,5 152,65 121,37 145,22 144,12 188,67 368,88 144,04 - - - 229,96 509,91 168,66 2,0 282,30 205,30 208,36 301,23 325,07 667,15 208,59 71,91 - 258,60 269,48 687,86 290,49 2,25 558,79 356,14 395,70 502,57 449,50 1003,78 237,16 158,74 77,92 505,16 289,08 1122,12 471,39 2,5 782,15 527,78 562,32 641,03 579,48 800,91 255,26 183,10 180,99 674,34 433,94 1144,70 563,83 2,75 585,31 980,16 694,21 763,47 866,11 620,83 333,41 234,78 272,59 1147,03 265,79 980,72 645,37 3,0 378,43 696,89 886,53 592,79 630,38 511,32 344,18 272,33 278,90 1186,96 205,83 856,67 570,10 3,5 215,81 570,65 575,14 423,17 396,03 360,75 640,22 530,02 448,04 1696,70 166,82 892,13 576,29 4,0 68,98 535,32 369,21 212,27 307,54 210,84 432,26 361,23 627,76 1483,71 157,02 685,38 454,29 6,0 - 130,85 64,16 54,83 96,49 56,96 377,31 346,84 138,52 800,84 59,06 181,58 192,29 8,0 - - - - - - 139,69 158,85 - 118,03 - - - 10,0 - - - - - - - - - - - - - 12,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
52
Bảng 3. 13: Nồng độ LPZ (ng/ml) trong huyết tương chó sau khi uống viên thử
Thời gian (giờ)
Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 Con 6 Con 7 Con 8 Con 9 Con 10 Con 11 Con 12 TB
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 - 52,16 - - - - - - - 1,0 117,09 282,26 117,50 86,44 62,58 142,34 - - 125,82 - - 231,06 97,09 1,5 274,08 358,79 219,23 179,20 176,13 224,49 - - 529,45 - 515,17 436,25 250,56 2,0 436,96 455,24 477,73 303,22 345,82 338,87 169,75 - 1163,14 58,72 785,47 479,96 419,31 2,25 672,32 526,04 691,17 408,18 405,20 445,75 263,08 - 771,58 81,52 648,73 435,27 447,66 2,5 874,28 620,25 543,79 454,99 501,65 611,94 204,76 153,33 542,47 70,49 514,32 398,25 457,54 2,75 598,84 552,79 406,90 499,07 662,44 731,54 302,61 287,92 282,07 314,33 261,76 276,06 431,36 3,0 402,87 435,55 374,26 542,90 562,47 622,02 451,86 239,66 223,87 501,87 130,86 189,31 389,79 3,5 248,23 292,57 294,35 432,69 384,94 406,46 469,39 101,93 154,86 299,08 85,89 110,25 273,39 4,0 167,68 210,88 183,13 283,85 202,35 250,93 256,71 - 75,14 159,72 - - 152,07 6,0 80,91 107,95 74,32 164,87 90,22 137,37 141,54 - - 73,21 - - 72,53 8,0 - - - 93,77 - - - - - - - 10,0 - - - - - - - - - - - 12,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
53
Từ các dữ liệu nồng độ LPZ trung bình trong huyết tương tại các thời
điểm lấy mẫu, vẽ đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian, kết quả được thể hiện trong hình 3.20.
Hình 3. 20: Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian của thuốc thử và thuốc đối chiếu
3.4.2. Phân tích và so sánh các thông số dược động học
Từ các kết quả ở bảng 3.12 và bảng 3.13, sử dụng phần mềmWinNonlin 5.2 để tính các thông số dược động học của LPZ đối với thuốc thử và thuốc đối chiếu theo mô hình không ngăn. Kết quả các thông số
54
Bảng 3. 14: Các thông số dược động học của thuốc thử và thuốc đối chiếu
Cmax (ng/ml) Tmax (giờ) AUC 0-t (ng.giờ/ml) AUC 0- ∞(ng.giờ/ml) Mã động vật
Ref Tes Ref Tes Ref Tes Ref Tes
1 782,1 874,3 2,5 2,5 1027,1 1542,4 1001,8 1652,2 2 980,2 620,3 2,75 2,5 2081,3 1731,2 2173,0 1906,9 3 886,5 691,2 3,0 2,25 1773,7 1423,1 1782,8 1487,4 4 763,5 542,9 2,75 3,0 1495,8 1879,1 1508,6 2124,0 5 866,1 662,4 2,75 2,75 1795,8 1478,1 1814,8 1534,1 6 1003,8 731,5 2,25 2,75 1923,8 1782,7 1941,4 1915,0 7 640,2 469,4 3,5 3,5 2397,0 1288,8 2725,4 1478,2 8 530,0 287,9 3,5 2,75 2001,1 306,3 2537,4 289,6 9 627,8 1163,1 4,0 2,0 1605,2 1439,9 1615,1 1420,9 10 1696,7 501,9 3,5 3,0 5673,9 845,0 5761,4 892,6 11 433,9 785,5 2,5 2,0 1167,2 1000,4 1177,6 1031,4 12 1144,7 480,0 2,5 2,0 3584,1 917,2 3684,3 975,7 TB 862,96 650,87 2,96 2,58 2210,50 1302,85 2310,30 1392,33 SD 333,71 227,11 0,54 0,47 1271,66 458,29 1308,08 517,67
55
Để so sánh các thông số dược động học của thuốc thử so với thuốc đối chiếu, tiến hành phân tích phương sai đểđánh giá ảnh hưởng của cá thể, trình tự thử thuốc, giai đoạn thử thuốc đến sự sai khác của các thông số dược động học. Các thông số về Cmax, AUC0- t và AUC0- ∞ được chuyển thành dạng logarit tự nhiên trước khi tiến hành phân tích.
3.4.2.1. Phân tích và so sánh Cmax
Kết quả phân tích phương sai cho Cmax được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3. 15: Kết quả phân tích phương sai Cmax
Nguồn biến thiên Bậc tự do (df) Tổng bình phương (SS) TB bình phương (MS) F P Trình tự thử 1 0,1873 0,1873 1,66 0,2265 Động vật TN 10 1,1277 0,1128 0,73 0,6857 Chế phẩm 1 0,4588 0,4588 2,97 0,1155 Giai đoạn 1 0,0032 0,0032 0,02 0,8884 Sai số 10 1,5441 0,1544 Tổng 23 3,3211
Khoảng tin cậy 90% của Cmax của thuốc thử so với thuốc đối chiếu: - Giới hạn trên: 101,44%
- Giới hạn dưới: 56,7%
Với mức ý nghĩa 0,95, kết quả phân tích phương sai của Cmax ở bảng 3.15 cho thấy:
- Về trình tự thử thuốc: Trình tự thử thuốc (thuốc thử trước, thuốc đối chiếu sau và ngược lại) ảnh hưởng đến Cmax không có ý nghĩa thống kê với P lớn hơn 0,05 (P = 0,2265).
- Về động vật thí nghiệm: Ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các cá thể đến Cmax không có ý nghĩa thống kê với P = 0,6857.
56
- Về chế phẩm: Sự khác nhau về Cmax giữa thuốc thử và thuốc đối chiếu là không có ý nghĩa thống kê với P = 0,1155.
- Về giai đoạn thử thuốc: Các giai đoạn thử thuốc không ảnh hưởng đến Cmax với P = 0,8884.
- Khoảng tin cậy 90% của Cmax đã chuyển dạng logarit của thuốc thử so với thuốc đối chiếu là 56,7%- 101,44%, không nằm trong khoảng từ 80% đến 125% chứng tỏ giá trị Cmax của thuốc thử là không tương đương với Cmax của thuốc đối chiếu theo quy định của FDA.
3.4.2.2. Phân tích và so sánh AUC0- t
Kết quả phân tích phương sai cho AUC0- t được trình bày trong bảng 3.16.
Bảng 3. 16: Kết quả phân tích phương sai AUC0- t
Nguồn biến thiên Bậc tự do (df) Tổng bình phương (SS) TB bình phương (MS) (MS = SS/df) F P Trình tự thử 1 0,0964 0,0964 0,58 0,4644 Động vật TN 10 1,6658 0,1666 0,90 0,5668 Chế phẩm 1 1,5342 1,5342 8,26 0,0166 Giai đoạn 1 1,4935 1,4935 8,04 0,0177 Sai số 10 1,8577 0,1858 Tổng 23 6,6476
Khoảng tin cậy 90% của AUC0- t của thuốc thử so với thuốc đối chiếu: - Giới hạn trên: 82,97%
- Giới hạn dưới: 43,84%
Với mức ý nghĩa 0,95, kết quả phân tích phương sai AUC0- t cho thấy: - Về trình tự thử thuốc: Trình tự thử thuốc ảnh hưởng đến AUC0- t không có ý nghĩa thống kê với P lớn hơn 0,05 (P = 0,4644).
57
- Về động vật thí nghiệm: Ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các cá thể đến AUC0- t không có ý nghĩa thống kê với P = 0,5668.
- Về chế phẩm: Sự khác nhau về AUC0- t giữa thuốc thử và thuốc đối chiếu là có ý nghĩa thống kê với P = 0,0166.
- Về giai đoạn thử thuốc: Các giai đoạn thử thuốc ảnh hưởng đến AUC0- t có ý nghĩa thống kê với P = 0,0177.
- Khoảng tin cậy 90% của AUC0- t đã chuyển dạng logarit của thuốc thử
so với thuốc đối chiếu là 43,84%- 82,97%, nằm ngoài khoảng từ 80% đến 125% chứng tỏ giá trị AUC0- t của thuốc thử là không tương đương với AUC0- t của thuốc đối chiếu theo quy định của FDA.
3.4.2.3. Phân tích và so sánh AUC0- ∞
Kết quả phân tích phương sai cho AUC0- ∞ được trình bày trong bảng 3.17.
Bảng 3. 17: Kết quả phân tích phương sai cho AUC0-∞
Nguồn biến thiên Bậc tự do (df) Tổng bình phương (SS) TB bình phương (MS) (MS = SS/df) F P Trình tự thử 1 0,0788 0,0788 0,46 0,5112 Động vật TN 10 1,6969 0,1697 0,79 0,6430 Chế phẩm 1 1,4442 1,4442 6,71 0,0269 Giai đoạn 1 1,8069 1,8069 8,39 0,0159 Sai số 10 2,1526 0,2153 Tổng 23 7,1794
Khoảng tin cậy 90% của AUC0- ∞ của thuốc thử so với thuốc đối chiếu: - Giới hạn trên: 86,31%
- Giới hạn dưới: 43,43%
Với mức ý nghĩa 0,95, kết quả phân tích phương sai AUC0- ∞ cho thấy: - Về trình tự thử thuốc: Trình tự thử thuốc ảnh hưởng đến AUC0- ∞ không có ý nghĩa thống kê với P lớn hơn 0,05 (P = 0,5112).
58
- Về động vật thí nghiệm: Ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các cá thể đến AUC0- ∞ không có ý nghĩa thống kê với P = 0,6430.
- Về chế phẩm: Sự khác nhau về AUC0- ∞ giữa thuốc thử và thuốc đối chiếu là có ý nghĩa thống kê với P = 0,0269.
- Về giai đoạn thử thuốc: Các giai đoạn thử thuốc ảnh hưởng đến AUC0- t có ý nghĩa thống kê với P = 0,0159.
- Khoảng tin cậy 90% của AUC0-∞ đã chuyển dạng logarit của thuốc thử
so với thuốc đối chiếu là 43,43%- 86,31%, nằm ngoài khoảng từ 80% đến 125% chứng tỏ giá trị AUC0-∞ của thuốc thử là không tương đương với AUC0-
∞ của thuốc đối chiếu theo quy định của FDA.
3.4.2.4. Phân tích và so sánh Tmax
Tmax được phân tích bằng phương pháp kiểm định phi tham số (kiểm
định Wilcoxon dấu xếp hạng), kết quả so sánh Tmax được trình bày trong bảng 3.18.
Bảng 3. 18: Kết quả phân tích Tmax
Tmax (giờ) Xếp hạng Mã động vật TN Thuốc ĐC Thuốc thử Khác nhau T+ T- 1 2,5 2,5 0 2 2,75 2,5 0,25 1,5 3 3 2,25 0,75 7,5 4 2,75 3 -0,25 1,5 5 2,75 2,75 0 6 2,25 2,75 -0,5 4,5 7 3,5 3,5 0 8 3,5 2,75 0,75 7,5 9 4 2 2 9 10 3,5 3 0,5 4,5 11 2,5 2 0,5 4,5 12 2,5 2 0,5 4,5 Tổng 39 6
59
Tra bảng Wilcoxon dấu xếp hạng với N = 9 (Số hiệu số khác 0) và mức ý nghĩa 0,95 được giá trị xác định là 6. Như vậy, sự khác nhau về Tmax giữa hai chế phẩm không có ý nghĩa thống kê với P > 0,05.
Nhận xét chung về so sánh các thông số dược động học của thuốc thử và thuốc đối chiếu trên chó:
Với mức ý nghĩa 0,95; 90% khoảng tin cậy của Cmax, AUC0- t và AUC0-∞ của thuốc thử so với thuốc đối chiếu không nằm trong khoảng 80%
đến 125% chứng tỏ mức độ hấp thu của thuốc thử và thuốc đối chiếu không tương đương nhau trên chó.
60
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LPZ TRONG HUYẾT TƯƠNG
Phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học có vai trò quan trọng trong việc có thể đánh giá đúng các số liệu về dược động học, đánh giá và phân tích các số liệu trong nghiên cứu SKD và TĐSH. Các phương pháp này cần phải được đánh giá và thẩm định để đảm bảo kết quả thu được khi phân tích bằng phương pháp đó là chính xác, ổn định và đáng tin cậy.
LPZ có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như
UV- VIS [21], [22] , phương pháp cực phổ [12], các phương pháp sắc ký... Để định lượng LPZ trong huyết tương, phương pháp phù hợp nhất là HPLC, có nhiều công trình đã công bố sử dụng phương pháp HPLC để định lượng LPZ trong huyết tương. Để phát hiện LPZ sau khi qua hệ thống sắc ký có thể dùng detector khối phổ [10], [32], [38] và detector quang phổ tử ngoại [9], [14], [27], với detector khối phổ độ nhạy cao tuy nhiên hiện chưa được dùng rộng rãi trong nước vì đầu tư lớn và cần nhiều điều kiện đảm bảo đi kèm (hệ thống nguồn cấp điện, nguồn cấp chân không...), đề tài trên đã sử dụng detector UV là phương pháp đơn giản, vẫn đảm bảo được độ nhạy (giới hạn định lượng) và phù hợp với điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm.
Phương pháp đã xây dựng được thẩm định trên đầy đủ các tiêu chí
trong việc đánh giá và thẩm định phương pháp phân tích theo yêu cầu của
FDA gồm: Tính đặc hiệu, chọn lọc; khoảng tuyến tính; độ đúng và độ lặp lại;
giới hạn định lượng; hiệu suất chiết; độ ổn định của LPZ trong dung dịch
chuẩn gốc và trong huyết tương.
- Lựa chọn chuẩn nội: Đối với phương pháp phân tích trong dịch sinh học, chuẩn nội đóng vai trò là yếu tố quan trọng. Chuẩn nội có tính chất lý hoá gần giống với chất phân tích, được cho vào cùng với chất phân tích để
61
hoá gần giống nhau, do vậy có thể sử dụng một trong các chất PPIs để định lượng các chất còn lại. Phương pháp trên dùng PPZ là một chất chuẩn dễ
kiếm, có cực đại hấp thụ gần với cực đại hấp thụ của LPZ làm chuẩn nội, lựa chọn này cũng phù hợp với nhiều phương pháp đã được công bố [20], [27], [36]. Ngoài các PPIs một số tác giả đã sử dụng chuẩn nội là những chất khác tuy nhiên các chất này đều khó kiếm [9], [13], [14], [28].
- Điều kiện sắc ký và tính đặc hiệu, chọn lọc: Các pha động với các tỷ
lệ khác nhau được khảo sát để tìm ra điều kiện sắc ký phù hợp dựa trên các thông số của pic sắc ký và độ ổn định của chất phân tích trong pha động. LPZ là chất kém bền, đặc biệt là trong môi trường có pH thấp do vậy pha động cần phải có pH phù hợp để LPZ ít bị phân huỷ nhưng vẫn đảm bảo tốt các thông số của pic sắc ký. Một số tác giả sử dụng pH của đệm là 3,0 là chưa hợp lý [23], nhưng chủ yếu các tác giả sử dụng pH của đệm là khoảng 7,0 [15], [19], [35] . Phương pháp đã xây dựng trên sử dụng dung dịch đệm đơn giản, dễ
kiếm, pH của đệm là 8,0 là hợp lý, ở pH này đảm bảo cho chất phân tích LPZ
ổn định trong quá trình phân tích và các thông số của pic sắc ký thu được: Số đĩa lý thuyết, hệ số phân giải, hệ số bất đối xứng đảm bảo tốt theo yêu cầu. Tính chọn lọc của phương pháp được xác định bằng cách so sánh tại vị
trí tương ứng với các pic cần quan tâm trên sắc ký đồ của các mẫu chuẩn và mẫu trắng. Phương pháp đảm bảo được có khả năng phát hiện ra LPZ trên một nền mẫu phức tạp là mẫu huyết tương.
- Khoảng tuyến tính: Đề tài đã xây dựng khoảng tuyến tính gồm 8 điểm bao gồm cả giới hạn định lượng (LLOQ) có nồng độ trong huyết tương từ
0,05 µg/ml đến 3,0 µg/ml, điều này phù hợp theo khuyến cáo của FDA [17], phù hợp với các nghiên cứu trước đây [13], [27]. Khoảng nồng độ đã xây dựng phù hợp với nồng độ thực tế của LPZ trong huyết tương chó khi cho
