2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Để xây dựng phương pháp định lượng LPZ trong huyết tương, các thông số về điều kiện sắc ký sau được khảo sát: Pha động (thành phần và tỷ lệ
các thành phần trong pha động, pH của pha động), bước sóng phát hiện, tốc
độ dòng…Trên cơ sở tham khảo tài liệu, phân tích những ưu điểm, nhược
điểm của các phương pháp phân tích trên, đề tài đã khảo sát một số điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: C18 150mm x 4,6mm; 5µm với bảo vệ cột cùng loại.
- Bước sóng phát hiện:
Pha các dung dịch LPZ và PPZ trong hỗn hợp MeOH- nước (70: 30, tt/tt) được các dung dịch có nồng độ khoảng 2 µg/ml. Tiến hành quét phổ UV của hai dung dịch trên, chọn bước sóng phát hiện phù hợp.
23
- Pha động: Khảo sát một số hệ pha động dưới đây với các tỷ lệ và pH khác nhau:
Dung dịch Kali dihydrophosphat 0,05 M: Methanol: ACN, điều chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch KOH 1 M.
Đệm phosphat (Kali dihydrophosphat) 10 mM : ACN, điều chỉnh pH
đến 7,3 bằng triethylamin.
Hỗn hợp MeOH: ACN: Dung dịch Dikali hydrophosphat 20 mM, điều chỉnh pH = 7,0 bằng acid phosphoric.
Hỗn hợp ACN: Dung dịch Dikali hydrophosphat 20 mM, điều chỉnh pH = 7,0 bằng acid phosphoric.
- Điều kiện sắc ký được khảo sát trên dung dịch chứa hỗn hợp LPZ chuẩn có nồng độ khoảng 1 µg/ml và PPZ chuẩn có nồng độ khoảng 2 µg/ml (dung dịch chuẩn hỗn hợp) được chuẩn bị trong pha động từ các dung dịch chuẩn gốc.
Lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho:
- Hệ số phân giải giữa LPZ và chuẩn nội PPZ không nhỏ hơn 5.
- Số đĩa lý thuyết của các pic tương ứng với LPZ và PPZ không nhỏ hơn 3000.
- Hệ số bất đối xứng của các pic tương ứng với LPZ và PPZ từ 0,9 đến 1,5.
- Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 10 phút.
- RSD% của thời gian lưu của các pic LPZ và PPZ với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 1,0%.
- RSD% của tỷ lệ diện tích pic giữa LPZ và PPZ của 6 lần tiêm lặp lại ở
nồng độđịnh lượng không lớn hơn 2,0%.
24
- Cân chính xác một lượng LPZ chuẩn và PPZ chuẩn hòa tan trong MeOH được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml (Dung dịch chuẩn LPZ gốc và dung dịch chuẩn nội PPZ gốc).
- Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng ngay trước khi dùng các dung dịch chuẩn và chuẩn nội gốc với MeOH.
2.2.3. Phương pháp chiết
Khảo sát một số phương pháp chiết khác nhau như sau:
- Tủa protein bằng MeOH, ly tâm, lấy dịch trong để tiêm sắc ký.
- Chiết bằng hỗn hợp diethyl ether- dicloromethan tỷ lệ 70: 30 (tt/tt). Sau
khi lắc, hỗn hợp được ly tâm, lấy lớp dung môi hữu cơ bốc hơi tới khô. Cắn
thu được hòa tan trong pha động rồi tiêm sắc ký.
- Chiết bằng tert- butyl methyl ether, ly tâm, lấy lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, cắn được hòa tan trong pha động để tiêm sắc ký.
2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích
2.2.4.1. Thẩm định tính đặc hiệu- chọn lọc
Xử lý mẫu theo qui trình đã được lựa chọn. Tiến hành chạy sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng; mẫu huyết tương có chuẩn nội; mẫu huyết tương có chuẩn LPZ và chuẩn nội (mẫu tự tạo). Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí ứng với thời gian lưu của LPZ và nội chuẩn.
Qui trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt
được LPZ và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của LPZ phải không vượt quá 20% đáp ứng của mẫu chuẩn tại LLOQ. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chuẩn nội phải không được vượt quá 5% đáp ứng của chuẩn nội.
2.2.4.2. Thẩm định độ tuyến tính
Từ các dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với MeOH được các dung dịch chuẩn làm việc LPZ có nồng độ: 2,5; 5; 10; 25; 50; 75; 100 và 150 µg/ml,
25
dung dịch chuẩn làm việc PPZ (chuẩn nội) có nồng độ 40 µg/ml. Thêm các dung dịch chuẩn làm việc LPZ và PPZ vào 490 µl huyết tương trắng và thu
được dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính như trong bảng sau:
Bảng 2. 1: Dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Huyết tương trắng (µl) 490 dd chuẩn LPZ (µl) 10 dd chuẩn PPZ 40 µg/ml (µl) 50 Nồng độ LPZ thu được (µg/ml) 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0
Tiếp tục xử lý mẫu bằng phương pháp đã xây dựng, cắn sau khi bốc hơi
được hòa tan trong ACN và đệm để tiêm sắc ký. Tính tỷ lệ giữa diện tích pic của LPZ với diện tích pic của chuẩn nội. Vẽ đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ LPZ và tỷ lệ diện tích pic, xác định độ đúng tính lại theo đường chuẩn. Hệ số tương quan tuyến tính r phải lớn hơn 0,995 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độđúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng
điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%.
2.2.4.3. Thẩm định độ đúng và độ lặp lại
Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu LQC, MQC và HQC chứa LPZ có nồng độ tương ứng là 0,2; 1,5 và 2,5 µg/ml. Xác định hàm lượng LPZ có trong các mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 6 mẫu (độ đúng và độ lặp lại trong ngày) và trong 3 ngày liên tiếp (độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày). Độđúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm
được và nồng độ thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng từ 85%- 115%, có thể chấp nhận 80- 120% đối với những điểm gần giới hạn định lượng. Độ
26
lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD%, RSD% không vượt quá 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%.
2.2.4.4. Giới hạn định lượng (LLOQ)
Dựa vào kết quả thẩm định độ tuyến tính, tiến hành xác định độ đúng,
độ lặp lại tại mẫu có nồng độ LPZ thấp nhất của đường chuẩn là 0,05 µg/ml. So sánh đáp ứng của mẫu này trên sắc ký đồ với mẫu trắng.
2.2.4.5. Độ ổn định
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc: So sánh nồng độ của dung dịch chuẩn gốc khi bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (từ 2- 80C) trong 3 ngày.
- Độổn định của mẫu huyết tương:
So sánh nồng độ của các mẫu huyết tương ngay sau khi thêm chuẩn LPZ và các mẫu được sau thời gian bảo quản ở 2 nồng độ LPZ là khoảng 0,2 và 2,0 µg/ml. Độ ổn định trong autosampler được xác định khi so sánh nồng
độ của các mẫu ở thời điểm ngay sau khi chiết, hoà tan trở lại bằng pha động và bảo quản trong khay đựng mẫu của autosampler ở nhiệt độ 50C trong 8 giờ.
Độ ổn định thời gian ngắn trong điều kiện ở nhiệt độ phòng sau 5 giờ; độ ổn
định dài ngày trong điều kiện bảo quản ở -450C trong 30 ngày. Độổn định sau
3 chu kỳ rã đông được tiến hành như sau: Mẫu huyết tương được để rã đông
hoàn toàn ở nhiệt độ phòng sau đó đưa lại điều kiện bảo quản trong 24 giờ,
lặp lại quá trình trên 2 lần nữa. Ở lần thứ 3, tiến hành xử lý và phân tích các
mẫu huyết tương đó theo phương pháp đã chọn, xác định nồng độ LPZ trong
các mẫu huyết tương bằng đường chuẩn được chuẩn bị đồng thời, so sánh
nồng độ xác định được với nồng độ ban đầu.
2.2.4.6. Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi)
- Hiệu suất chiết của LPZ: Pha các mẫu LPZ trong huyết tương có nồng
độ khoảng 0,2; và 2,0 µg/ml với 6 mẫu cho một nồng độ, song song chuẩn bị
mẫu có nồng độ LPZ như trên trong pha động. Tiến hành xử lý và phân tích mẫu huyết tương theo phương pháp đã chọn, tính hiệu suất chiết là tỷ lệ phần
27
trăm của trung bình diện tích pic LPZ trong mẫu huyết tương với trung bình diện tích pic LPZ trong mẫu pha trong pha động.
- Hiệu suất chiết của chuẩn nội: Thêm 50 µl dung dịch chuẩn nội PPZ có nồng độ 40 µg/ml vào 500µl huyết tương trắng. Tiến hành xử lý và phân tích bằng phương pháp đã chọn, song song chuẩn bị mẫu có nồng độ PPZ như trên trong pha động, tiến hành lặp lại trên 6 mẫu, tính hiệu suất chiết của chuẩn nội.
2.2.5. Đánh giá sinh khả dụng của viên nang LPZ 30 mg
2.2.5.1. Thiết kế thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo phương pháp chéo đôi, ngẫu nhiên đơn liều mô phỏng theo mô hình thử TĐSH của FDA. Chó được nuôi và theo dõi ổn định trước khi đưa vào thí nghiệm 3 ngày, nhịn đói 24 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.
12 chó đực khoẻ mạnh, cân nặng 10 - 12 kg được chia thành 2 nhóm ngẫu nhiên với 2 giai đoạn thử như sau:
Bảng 2. 2:Bố trí thí nghiệm đánh giá SKD của viên nang LPZ 30 mg
- Giai đoạn 1: Nhóm 1 được uống thuốc đối chiếu, mỗi chó trong nhóm uống 1 viên nang quy ước chứa pellet lansoprazol bao tan ở ruột hàm lượng 30 mg với 100 ml nước. Nhóm 2 được uống thuốc thử, mỗi chó trong nhóm uống 1 viên nang chứa pellet lansoprazol bao tan ở ruột hàm lượng 30 mg bào chếđược với 100 ml nước.
Giai đoạn
Nhóm 1 2
1 Thuốc đối chiếu (R) Thuốc thử (T) 2 Thuốc thử (T) Thuốc đối chiếu (R)
28
- Giai đoạn 2: Tiến hành ngược lại giai đoạn 1, nhóm 1 được uống thuốc thử và nhóm 2 được uống thuốc đối chiếu. Giai đoạn 2 được tiến hành sau giai đoạn 1 ba ngày.
2.2.2.2. Phương pháp lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu tại thời điểm ngay trước khi cho chó uống thuốc và tại các thời điểm sau khi uống thuốc 0,5; 1; 1,5; 2; 2,25; 2,5; 2,75; 3; 3,5; 4; 6; 8; 10; 12 và 24 giờ. Mỗi điểm lấy khoảng 3 ml máu tĩnh mạch cổ cho vào ống nghiệm có tráng sẵn chất chống đông heparin, lắc nhẹ, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 7 phút, hút lấy phần huyết tương. Mẫu huyết tương được bảo quản ở -450C đến khi phân tích.
2.2.2.3. Phương pháp chiết và định lượng LPZ
Xử lý mẫu huyết tương và định lượng LPZ trong huyết tương bằng phương pháp đã thẩm định.
2.2.2.4. Phương pháp xác định một số thông số dược động học
- Cmax và Tmax: Thu được trực tiếp từ thí nghiệm.
- AUC0-t (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0
đến thời điểm t) được tính theo phương pháp hình thang với t là thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được.
- AUC0-∞ (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0
đến vô cùng) được tính theo công thức:
AUC0-∞ = AUC0-t + AUCt-∞ AUCt-∞ = Ct / Kel
Trong đó: Ct : Nồng độ của thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng.
Kel : Hằng số tốc độ thải trừ của thuốc.
- t1/2 (thời gian bán thải của thuốc) được tính bằng công thức: t1/2 = 0,693 / Kel
29
2.2.2.5. Phương pháp so sánh các thông số dược động học
Sử dụng phương pháp “khoảng tin cậy 90%” theo quy định của FDA
để so sánh các thông số dược động học như AUC0- t, AUC0-∞, Cmax của thuốc thử và thuốc đối chiếu (số liệu chuyển qua dạng logarit).
Tính khoảng tin cậy 90% được tính theo công thức sau: CI = µT - µR± t 0,1;n× S 2/N
Trong đó : CI : Khoảng tin cậy 90%.
µT, µR : Giá trị trung bình của thuốc thử và thuốc đối chiếu. t 0,1;n : Giá trị tra bảng Student t - test.
S : Căn bậc hai trung bình bình phương của sai số ngẫu nhiên phân tích từ phương sai của thiết kế.
N : Tổng các đối tượng thử trong thiết kế thí nghiệm chéo đôi. Hai chế phẩm được coi là tương đương nếu CI nằm trong khoảng từ 80%
đến 125%.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Dựa vào phần mềm Microsoft Excel: + Giá trị trung bình: + Độ lệch chuẩn: SD =
( )
1
1 2−
−
∑
=n
x
xi
n i ; tương ứng với hàm STDEV trong Microsoft Excel.+ Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) và hệ số biến thiên (CV %): RSD (%) = CV (%) =
× 100
x
SD
+ Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích: y = ax + b
x1 + x2 + x3 +… + xn x =
30
- Phân tích các thông số dược động học và tương đương sinh học: Sử
dụng phần mềmWinNonlin 5.2.
31
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ VÀ TÍNH TƯƠNG THÍCH CỦA HỆ
THỒNG
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành quét phổ UV trong khoảng bước sóng từ 200- 400 nm của các dung dịch LPZ và PPZ trong MeOH ở nồng độ mỗi chất khoảng 2 µg/ml thu được trên phổ đồ, LPZ có cực đại ở bước sóng 283,62 nm; PPZ có cực đại
ở 287,65 nm; do vậy bước sóng phát hiện được chọn là 285 nm với cả LPZ và PPZ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trên cơ sở tham khảo tài liệu, đề tài lựa chọn một số điều kiện cố định như sau: Cột Symmetry C18, 150 x 4,6 mm; 5µm với bảo vệ cột C18, 20 x 3,9 mm; 5µm,Waters; tốc độ dòng là 1,0 ml/phút.
Do tính chất của LPZ, không bền ở pH acid do vậy các dung dịch đệm của pha động được điều chỉnh pH trong khoảng 7,0 đến 8,0 để giảm sự phân huỷ của LPZ. - Khảo sát điều kiện sắc ký 1 với pha động là hỗn hợp của KH2PO4 0,005M, điều chỉnh pH về 7,0 bằng KOH 1M và ACN với tỷ lệ 50: 50 (tt/tt) thu được sắc đồở hình 3.1. M in u te s 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 mc AU -0 .0 0 2 -0 .0 0 1 0 .0 0 0 0 .0 0 1 0 .0 0 2 0 .0 0 3 Pan top raz ol 6.8 38 La ns op razo l 1 2.3 78
32
Trên sắc đồ, đường nền tương đối phẳng, hai pic LPZ và PPZ đã tách khỏi nhau hoàn toàn (hệ số phân giải là 12,2), các pic sắc nét, cân đối (hệ số
bất đối xứng khoảng 1,2). Tuy nhiên, số đĩa lý thuyết của cột không cao (cao nhất khoảng 2000 với LPZ), và thời gian lưu của LPZ dài (12,4 phút), như
vậy thời gian phân tích cho một quy trình dài và tốn dung môi hoá chất.
- Với điều kiện sắc ký 2 có pha động là hỗn hợp gồm nước: ACN: triethylamin (60: 40: 1, tt/tt), điều chỉnh pH về 7,0 bằng acid phosphoric. Trên sắc đồ thấy đường nền phẳng, hai pic LPZ và PPZ đã tách khỏi nhau hoàn toàn (hệ số phân giải là 5,5). Tuy vậy, các pic chưa cân đối (hệ số bất đối xứng là 1,3) và số đĩa lý thuyết của cột chưa cao (khoảng 1000 với PPZ và 2000 với LPZ). Sắc đồđược thể hiện trong hình 3.2. M in u te s 0 1 2 3 4 5 6 7 8 mcA U -0 .0 1 0 -0 .0 0 5 0 .0 0 0 0 .0 0 5 0 .0 1 0 0 .0 1 5 Pa nt op ra zol 4. 73 0 La ns o pr az ol 6. 61 0
Hình 3. 2: SKĐ dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký 2
- Với pha động là hỗn hợp gồm ACN và 5 ml triethylamin trong 500 ml nước, điều chỉnh pH về 7,0 bằng acid phosphoric với tỷ lệ 40: 60 (tt/tt) (điều kiện sắc ký 3). Trên SKĐ thấy các pic LPZ, PPZ cân đối, tách khỏi nhau hoàn toàn. Nhưng đáp ứng của pic dung môi lớn và số đĩa lý thuyết chưa đảm bảo (khoảng 1500 với pic PPZ và 2000 với pic LPZ). Sắc đồ được thể hiện trong hình 3.3.
33 M in u te s 0 1 2 3 4 5 6 7 8 mcA U -0 .0 1 0 .0 0 0 .0 1
