Phân tích mẫu thử

Định lượng các mẫu thử bằng phương pháp phân tích đã được thẩm

định. Mỗi mẫu thử có thể phân tích 1 lần hoặc lặp lại nếu cần. Với mỗi lô mẫu phân tích sinh học (các mẫu phân tích cùng một thời gian trong một buổi hoặc ngày), nên thiết lập một đường chuẩn mới để phân tích và dùng các mẫu QC với 3 nồng độ (thấp, trung bình và cao) để định lượng đồng thời trong mỗi lô phân tích. Nói chung, độ lệch giữa các kết quả của mẫu chuẩn đối chiếu không được quá 20% [3], [16], [17].

1.3. SINH KHẢ DỤNG VÀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG

SKD biểu thị tốc độ và mức độ hấp thu của dược chất từ chế phẩm thuốc vào hệ tuần hoàn. Hai chế phẩm được coi là TĐSH nếu sinh khả dụng khác nhau không đáng kể khi dùng cùng mức liều trong cùng điều kiện thử

nghiệm.

Mức độ hấp thu dược chất từ các chế phẩm dùng đường uống hoặc dùng tại chỗ có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Trong đó, các yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến quá trình hấp thu như kỹ thuật sản xuất, kích thước hạt,

18

dạng tinh thể của dược chất, các tá dược như: tá dược độn, dính, rã, trơn, bao, tá dược làm tăng độ tan, tá dược gây tác dụng kéo dài… SKD là một chỉ số

quan trọng trong đảm bảo chất lượng thực của sản phẩm, và TĐSH là cơ sở

chủ yếu để đảm bảo độđồng nhất về chất lượng của cùng một dược chất giữa các chế phẩm khác nhau. Hai khái niệm này không hoàn toàn giống nhau, nhưng về phương pháp thử nghiệm thì tương tự. Chế phẩm thuốc có cần phải

đánh giá SKD và TĐSH hay không tuỳ thuộc vào quy định của các cơ quan quản lý [1], [3], [34].

1.3.1. Phân tích dược động học

Lập các bảng và hình để biểu thị các dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương vào những thời điểm lấy mẫu khác nhau của từng cá thể, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Sau đó tính các thông số dược động học của mỗi cá thể, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn cho mỗi thông số. Những thông số

dược động học chính là nồng độ đỉnh trong máu (Cmax), diện tích dưới đường cong nồng độ- thời gian (AUC), thời gian bán thải (T1/2) và thời điểm đạt nồng độ đỉnh trong máu (Tmax). Cmax và Tmax biểu thị bằng số liệu thu được trực tiếp từ thí nghiệm không phải tính toán. AUC0- t (diện tích dưới đường cong nồng độ- thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t) được tính toán theo phương pháp hình thang, với t là thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được. AUC0- ∞ (diện tích dưới đường cong nồng độ- thời gian từ thời

điểm 0 đến vô cùng được tính toán theo công thức: AUC0- ∞ = AUC0- t + Ct/λz

Trong đó: Ct là nồng độ của thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng,

λz là hằng số tốc độ thải trừ.

T1/2 có thểđược tính bằng công thức: T1/2 = 0,693/λz

Trong đó: λz được tính từ độ dốc của đoạn tuyến tính trên đường biểu diễn logarit nồng độ- thời gian.

19

1.3.2. Tính toán sinh khả dụng

1.3.2.1. Dùng đơn liều

SKD F được tính toán lần lượt bằng cách sử dụng AUC0-t và AUC0-∞

của mỗi cá thể, đồng thời tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Khi liều của thuốc thử (T) giống với liều của thuốc đối chứng (R).

F= (AUC0-t)T/ (AUC0-t)R x 100% F= (AUC0-∞)T/ (AUC0-∞)R x 100%

Khi liều thuốc thử khác với liều thuốc đối chứng và chất được phân tích

đặc trưng cho dược động học tuyến tính, chỉ số F có thể được thay đổi phụ

thuộc vào liều và được thể hiện dưới đây:

F= [(AUC0-t)T x DR/(AUC0-t)R x DT] x 100% F= [(AUC0-∞)T x DR/(AUC0-∞)Rx DT] x 100% Trong đó: DR và DT là liều uống của thuốc chứng và thuốc thử.

Phân tích các chất chuyển hoá: Một vài thuốc là dạng tiền chất của thuốc không thể định lượng được trong máu vì dạng tiền thuốc chuyển hoá rất nhanh trong cơ thể. SKD của những loại thuốc này có thể được đánh giá qua

đáp ứng thích hợp của chất chuyển hoá có hoạt tính.

F = [(AUC0-t)mTx DR / (AUC0-t)mR x DT] x 100% F = [(AUC0-∞)mT x DR / (AUC0-∞)mR x DT] x 100% Trong đó: m là ký hiệu cho chất chuyển hóa.

Đánh giá kết quả chủ yếu dựa vào số liệu AUC0-t và AUC0-∞được dùng như một đối chứng [1], [3], [34].

1.3.2.2. Dùng đa liều

Nếu trạng thái ổn định đạt được sau khi uống nhiều liều, SKD có thể được ước tính bằng trung bình nồng độ thuốc trong huyết tương ở trạng thái

ổn định.

- Mức độ hấp thu của thuốc tương tự nhau, nhưng có thể khác về tốc độ

20 - SKD giữa các cá thể khác nhau nhiều.

- Thuốc giải phóng có kiểm soát, tác dụng kéo dài

- Sau khi uống liều đơn, nồng độ của thuốc dưới dạng tiền chất của thuốc hoặc chất chuyển hoá thấp, không thể xác định được bởi phương pháp phân tích thích hợp.

Sau khi uống đa liều với cách khoảng thời gian t bằng nhau có thể đạt tới trạng thái ổn định, lấy mẫu máu nhiều lần trong quá trình uống thuốc. Phân tích xác định nồng độ thuốc và tính giá trị AUCss0-t. Khi liều của thuốc thử giống thuốc đối chứng, SKD tương đối có thể được tính toán theo biểu thức:

F = (AUCsst/ AUCssR) x 100%

Trong đó: AUCsst và AUCssR là AUC ở trạng thái ổn định của chế phẩm thử

21

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Dược phẩm

- Thuốc đối chiếu: Lansoprazol TEVA® Santé 30 mg; lô sản xuất H006; hạn dùng: 03/2015 (Pháp).

- Thuốc thử nghiệm: Viên nang Lansoprazol 30 mg do một labo của Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, dung môi

- Chất chuẩn Lansoprazol - Viện kiểm nghiệm thuốc TW, hàm lượng 99,5% (hiện trạng); SKS: 0106203.

- Chất chuẩn Pantoprazol natri - Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM, hàm lượng 93,87% (hiện trạng); SKS: QT 219 011212.

- Methanol, ACN loại dùng cho sắc ký lỏng – Merck (Đức). - Tert- butyl methyl ether (PS) - Merck (Đức).

- Dicloromethan (PA) - Merck (Đức). - Diethyl ether - Trung Quốc (PA).

- Dikali hydrophosphat (PA) - Prolabo (Mỹ). - Kali dihydrophosphat (PA) - Merck (Đức). - Kali hydroxyd - Trung Quốc (PA).

- Triethylamin (PA) - Merck (Đức)

- Một số dung môi, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.

2.1.3. Dụng cụ, máy móc

- Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp, autosamler - Nhật; cột sắc ký Symmetry C18 150 x 4,6 mm; 5 µm và bảo vệ cột Symmetry C18 20 x 3,9 mm; 5 µm -Waters.

22

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Perkin Elmer UV - VIS Lambda 12 -

Đức.

- Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5804R. - Máy lắc vortex Heidolph.

- Máy đo pH Thermo Orion 420A plus - Thuỵ Sỹ. - Máy cô quay chân không miVAC.

- Các loại pipet, micropipette, bình định mức…, các loại dụng cụ lấy mẫu: bơm tiêm, ống ly tâm, ống đựng huyết tương.

- Các thiết bị trên được hiệu chuẩn định kỳ theo thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc (GLP), và các loại dụng cụ thủy tinh đạt Glass A.

2.1.4. Đối tượng nghiên cứu

- Huyết tương chó được lấy từ chó đực khoẻ mạnh, cân nặng từ 10 - 12 kg.

- Chó đực khoẻ mạnh, cân nặng 10 - 12 kg.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

Để xây dựng phương pháp định lượng LPZ trong huyết tương, các thông số về điều kiện sắc ký sau được khảo sát: Pha động (thành phần và tỷ lệ

các thành phần trong pha động, pH của pha động), bước sóng phát hiện, tốc

độ dòng…Trên cơ sở tham khảo tài liệu, phân tích những ưu điểm, nhược

điểm của các phương pháp phân tích trên, đề tài đã khảo sát một số điều kiện sắc ký như sau:

- Cột sắc ký: C18 150mm x 4,6mm; 5µm với bảo vệ cột cùng loại.

- Bước sóng phát hiện:

Pha các dung dịch LPZ và PPZ trong hỗn hợp MeOH- nước (70: 30, tt/tt) được các dung dịch có nồng độ khoảng 2 µg/ml. Tiến hành quét phổ UV của hai dung dịch trên, chọn bước sóng phát hiện phù hợp.

23

- Pha động: Khảo sát một số hệ pha động dưới đây với các tỷ lệ và pH khác nhau:

Dung dịch Kali dihydrophosphat 0,05 M: Methanol: ACN, điều chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch KOH 1 M.

Đệm phosphat (Kali dihydrophosphat) 10 mM : ACN, điều chỉnh pH

đến 7,3 bằng triethylamin.

Hỗn hợp MeOH: ACN: Dung dịch Dikali hydrophosphat 20 mM, điều chỉnh pH = 7,0 bằng acid phosphoric.

Hỗn hợp ACN: Dung dịch Dikali hydrophosphat 20 mM, điều chỉnh pH = 7,0 bằng acid phosphoric.

- Điều kiện sắc ký được khảo sát trên dung dịch chứa hỗn hợp LPZ chuẩn có nồng độ khoảng 1 µg/ml và PPZ chuẩn có nồng độ khoảng 2 µg/ml (dung dịch chuẩn hỗn hợp) được chuẩn bị trong pha động từ các dung dịch chuẩn gốc.

Lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho:

- Hệ số phân giải giữa LPZ và chuẩn nội PPZ không nhỏ hơn 5.

- Số đĩa lý thuyết của các pic tương ứng với LPZ và PPZ không nhỏ hơn 3000.

- Hệ số bất đối xứng của các pic tương ứng với LPZ và PPZ từ 0,9 đến 1,5.

- Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 10 phút.

- RSD% của thời gian lưu của các pic LPZ và PPZ với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 1,0%.

- RSD% của tỷ lệ diện tích pic giữa LPZ và PPZ của 6 lần tiêm lặp lại ở

nồng độđịnh lượng không lớn hơn 2,0%.

24

- Cân chính xác một lượng LPZ chuẩn và PPZ chuẩn hòa tan trong MeOH được dung dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml (Dung dịch chuẩn LPZ gốc và dung dịch chuẩn nội PPZ gốc).

- Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng ngay trước khi dùng các dung dịch chuẩn và chuẩn nội gốc với MeOH.

2.2.3. Phương pháp chiết

Khảo sát một số phương pháp chiết khác nhau như sau:

- Tủa protein bằng MeOH, ly tâm, lấy dịch trong để tiêm sắc ký.

- Chiết bằng hỗn hợp diethyl ether- dicloromethan tỷ lệ 70: 30 (tt/tt). Sau khi lắc, hỗn hợp được ly tâm, lấy lớp dung môi hữu cơ bốc hơi tới khô. Cắn thu được hòa tan trong pha động rồi tiêm sắc ký.

- Chiết bằng tert- butyl methyl ether, ly tâm, lấy lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, cắn được hòa tan trong pha động để tiêm sắc ký.

2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích

2.2.4.1. Thẩm định tính đặc hiệu- chọn lọc

Xử lý mẫu theo qui trình đã được lựa chọn. Tiến hành chạy sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng; mẫu huyết tương có chuẩn nội; mẫu huyết tương có chuẩn LPZ và chuẩn nội (mẫu tự tạo). Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí ứng với thời gian lưu của LPZ và nội chuẩn.

Qui trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt

được LPZ và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của LPZ phải không vượt quá 20% đáp ứng của mẫu chuẩn tại LLOQ. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chuẩn nội phải không được vượt quá 5% đáp ứng của chuẩn nội.

2.2.4.2. Thẩm định độ tuyến tính

Từ các dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với MeOH được các dung dịch chuẩn làm việc LPZ có nồng độ: 2,5; 5; 10; 25; 50; 75; 100 và 150 µg/ml,

25

dung dịch chuẩn làm việc PPZ (chuẩn nội) có nồng độ 40 µg/ml. Thêm các dung dịch chuẩn làm việc LPZ và PPZ vào 490 µl huyết tương trắng và thu

được dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính như trong bảng sau:

Bảng 2. 1: Dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Huyết tương trắng (µl) 490 dd chuẩn LPZ (µl) 10 dd chuẩn PPZ 40 µg/ml (µl) 50 Nồng độ LPZ thu được (µg/ml) 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0

Tiếp tục xử lý mẫu bằng phương pháp đã xây dựng, cắn sau khi bốc hơi

được hòa tan trong ACN và đệm để tiêm sắc ký. Tính tỷ lệ giữa diện tích pic của LPZ với diện tích pic của chuẩn nội. Vẽ đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ LPZ và tỷ lệ diện tích pic, xác định độ đúng tính lại theo đường chuẩn. Hệ số tương quan tuyến tính r phải lớn hơn 0,995 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độđúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng

điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%.

2.2.4.3. Thẩm định độ đúng và độ lặp lại

Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu LQC, MQC và HQC chứa LPZ có nồng độ tương ứng là 0,2; 1,5 và 2,5 µg/ml. Xác định hàm lượng LPZ có trong các mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 6 mẫu (độ đúng và độ lặp lại trong ngày) và trong 3 ngày liên tiếp (độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày). Độđúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm

được và nồng độ thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng từ 85%- 115%, có thể chấp nhận 80- 120% đối với những điểm gần giới hạn định lượng. Độ

26

lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD%, RSD% không vượt quá 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%.

2.2.4.4. Giới hạn định lượng (LLOQ)

Dựa vào kết quả thẩm định độ tuyến tính, tiến hành xác định độ đúng,

độ lặp lại tại mẫu có nồng độ LPZ thấp nhất của đường chuẩn là 0,05 µg/ml. So sánh đáp ứng của mẫu này trên sắc ký đồ với mẫu trắng.

2.2.4.5. Độ ổn định

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc: So sánh nồng độ của dung dịch chuẩn gốc khi bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (từ 2- 80C) trong 3 ngày.

- Độổn định của mẫu huyết tương:

So sánh nồng độ của các mẫu huyết tương ngay sau khi thêm chuẩn LPZ và các mẫu được sau thời gian bảo quản ở 2 nồng độ LPZ là khoảng 0,2 và 2,0 µg/ml. Độ ổn định trong autosampler được xác định khi so sánh nồng

độ của các mẫu ở thời điểm ngay sau khi chiết, hoà tan trở lại bằng pha động và bảo quản trong khay đựng mẫu của autosampler ở nhiệt độ 50C trong 8 giờ.

Độ ổn định thời gian ngắn trong điều kiện ở nhiệt độ phòng sau 5 giờ; độ ổn

định dài ngày trong điều kiện bảo quản ở -450C trong 30 ngày. Độổn định sau 3 chu kỳ rã đông được tiến hành như sau: Mẫu huyết tương được để rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng sau đó đưa lại điều kiện bảo quản trong 24 giờ, lặp lại quá trình trên 2 lần nữa. Ở lần thứ 3, tiến hành xử lý và phân tích các mẫu huyết tương đó theo phương pháp đã chọn, xác định nồng độ LPZ trong các mẫu huyết tương bằng đường chuẩn được chuẩn bị đồng thời, so sánh nồng độ xác định được với nồng độ ban đầu.

2.2.4.6. Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi)

- Hiệu suất chiết của LPZ: Pha các mẫu LPZ trong huyết tương có nồng

độ khoảng 0,2; và 2,0 µg/ml với 6 mẫu cho một nồng độ, song song chuẩn bị

mẫu có nồng độ LPZ như trên trong pha động. Tiến hành xử lý và phân tích mẫu huyết tương theo phương pháp đã chọn, tính hiệu suất chiết là tỷ lệ phần

27

trăm của trung bình diện tích pic LPZ trong mẫu huyết tương với trung bình diện tích pic LPZ trong mẫu pha trong pha động.

- Hiệu suất chiết của chuẩn nội: Thêm 50 µl dung dịch chuẩn nội PPZ có nồng độ 40 µg/ml vào 500µl huyết tương trắng. Tiến hành xử lý và phân tích bằng phương pháp đã chọn, song song chuẩn bị mẫu có nồng độ PPZ như trên