Khảo sát một số phương pháp chiết khác nhau như sau:
- Tủa protein bằng MeOH, ly tâm, lấy dịch trong để tiêm sắc ký.
- Chiết bằng hỗn hợp diethyl ether- dicloromethan tỷ lệ 70: 30 (tt/tt). Sau khi lắc, hỗn hợp được ly tâm, lấy lớp dung môi hữu cơ bốc hơi tới khô. Cắn thu được hòa tan trong pha động rồi tiêm sắc ký.
- Chiết bằng tert- butyl methyl ether, ly tâm, lấy lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, cắn được hòa tan trong pha động để tiêm sắc ký.
2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích
2.2.4.1. Thẩm định tính đặc hiệu- chọn lọc
Xử lý mẫu theo qui trình đã được lựa chọn. Tiến hành chạy sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng; mẫu huyết tương có chuẩn nội; mẫu huyết tương có chuẩn LPZ và chuẩn nội (mẫu tự tạo). Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí ứng với thời gian lưu của LPZ và nội chuẩn.
Qui trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt
được LPZ và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của LPZ phải không vượt quá 20% đáp ứng của mẫu chuẩn tại LLOQ. Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chuẩn nội phải không được vượt quá 5% đáp ứng của chuẩn nội.
2.2.4.2. Thẩm định độ tuyến tính
Từ các dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với MeOH được các dung dịch chuẩn làm việc LPZ có nồng độ: 2,5; 5; 10; 25; 50; 75; 100 và 150 µg/ml,
25
dung dịch chuẩn làm việc PPZ (chuẩn nội) có nồng độ 40 µg/ml. Thêm các dung dịch chuẩn làm việc LPZ và PPZ vào 490 µl huyết tương trắng và thu
được dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính như trong bảng sau:
Bảng 2. 1: Dãy nồng độ thẩm định độ tuyến tính STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Huyết tương trắng (µl) 490 dd chuẩn LPZ (µl) 10 dd chuẩn PPZ 40 µg/ml (µl) 50 Nồng độ LPZ thu được (µg/ml) 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0
Tiếp tục xử lý mẫu bằng phương pháp đã xây dựng, cắn sau khi bốc hơi
được hòa tan trong ACN và đệm để tiêm sắc ký. Tính tỷ lệ giữa diện tích pic của LPZ với diện tích pic của chuẩn nội. Vẽ đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ LPZ và tỷ lệ diện tích pic, xác định độ đúng tính lại theo đường chuẩn. Hệ số tương quan tuyến tính r phải lớn hơn 0,995 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độđúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng
điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%.
2.2.4.3. Thẩm định độ đúng và độ lặp lại
Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu LQC, MQC và HQC chứa LPZ có nồng độ tương ứng là 0,2; 1,5 và 2,5 µg/ml. Xác định hàm lượng LPZ có trong các mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 6 mẫu (độ đúng và độ lặp lại trong ngày) và trong 3 ngày liên tiếp (độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày). Độđúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm
được và nồng độ thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng từ 85%- 115%, có thể chấp nhận 80- 120% đối với những điểm gần giới hạn định lượng. Độ
26
lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD%, RSD% không vượt quá 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%.
2.2.4.4. Giới hạn định lượng (LLOQ)
Dựa vào kết quả thẩm định độ tuyến tính, tiến hành xác định độ đúng,
độ lặp lại tại mẫu có nồng độ LPZ thấp nhất của đường chuẩn là 0,05 µg/ml. So sánh đáp ứng của mẫu này trên sắc ký đồ với mẫu trắng.
2.2.4.5. Độ ổn định
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc: So sánh nồng độ của dung dịch chuẩn gốc khi bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh (từ 2- 80C) trong 3 ngày.
- Độổn định của mẫu huyết tương:
So sánh nồng độ của các mẫu huyết tương ngay sau khi thêm chuẩn LPZ và các mẫu được sau thời gian bảo quản ở 2 nồng độ LPZ là khoảng 0,2 và 2,0 µg/ml. Độ ổn định trong autosampler được xác định khi so sánh nồng
độ của các mẫu ở thời điểm ngay sau khi chiết, hoà tan trở lại bằng pha động
và bảo quản trong khay đựng mẫu của autosampler ở nhiệt độ 50C trong 8 giờ.
Độ ổn định thời gian ngắn trong điều kiện ở nhiệt độ phòng sau 5 giờ; độ ổn
định dài ngày trong điều kiện bảo quản ở -450C trong 30 ngày. Độổn định sau 3 chu kỳ rã đông được tiến hành như sau: Mẫu huyết tương được để rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng sau đó đưa lại điều kiện bảo quản trong 24 giờ, lặp lại quá trình trên 2 lần nữa. Ở lần thứ 3, tiến hành xử lý và phân tích các mẫu huyết tương đó theo phương pháp đã chọn, xác định nồng độ LPZ trong các mẫu huyết tương bằng đường chuẩn được chuẩn bị đồng thời, so sánh nồng độ xác định được với nồng độ ban đầu.
2.2.4.6. Hiệu suất chiết (Tỷ lệ thu hồi)
- Hiệu suất chiết của LPZ: Pha các mẫu LPZ trong huyết tương có nồng
độ khoảng 0,2; và 2,0 µg/ml với 6 mẫu cho một nồng độ, song song chuẩn bị
mẫu có nồng độ LPZ như trên trong pha động. Tiến hành xử lý và phân tích mẫu huyết tương theo phương pháp đã chọn, tính hiệu suất chiết là tỷ lệ phần
27
trăm của trung bình diện tích pic LPZ trong mẫu huyết tương với trung bình diện tích pic LPZ trong mẫu pha trong pha động.
- Hiệu suất chiết của chuẩn nội: Thêm 50 µl dung dịch chuẩn nội PPZ có nồng độ 40 µg/ml vào 500µl huyết tương trắng. Tiến hành xử lý và phân tích bằng phương pháp đã chọn, song song chuẩn bị mẫu có nồng độ PPZ như trên trong pha động, tiến hành lặp lại trên 6 mẫu, tính hiệu suất chiết của chuẩn nội.
