3.2.1. Phƣơng pháp trích ly dịch nha đam
Nha đam sau khi xử lý đƣợc trích ly trong dung môi bằng phƣơng pháp xay nhuyễn rồi lọc để thu dịch. Chọn chế độ thanh trùng để thu đƣợc dịch nha đam đảm bảo vi sinh, đồng thời còn giữ đƣợc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 19
3.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn và nấm mốc
Mẫu xoài và chanh sau thời gian bảo quản xuất hiện vi khuẩn, nấm mốc, tiến hành phân lập, nuôi cấy, bảo quản trên môi trƣờng dinh dƣỡng để thu giống vi sinh vật.
3.2.3. Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch nha đam
Từ các giống vi sinh vật phân lập đƣợc, cấy lên môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung dịch nha đam, tiến hành kiểm tra đƣờng kính vòng kháng khuẩn và đƣờng kính nấm mốc phát triển trên môi trƣờng có dịch nha đam ở các chế độ thanh trùng, thể tích khác nhau.
3.2.4. Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả
Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 2 hoặc 3 lần lặp lại.
Số liệu đƣợc thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XVI, phần mềm Excel. Phân tích phƣơng sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình và nghiệm thức.
3.3. NỘI DUNG THÍ NGHIỆM
3.3.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu phƣơng pháp trích ly dịch nha đam - Mục đích: - Mục đích:
Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ, thời gian thanh trùng đến chất lƣợng dịch nha đam sau khi trích ly bằng dung môi là nƣớc với tỉ lệ dung môi : nha đam là 1:1.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc tiến hành ngẫu nhiên với 2 nhân tố. Nhân tố A: Nhiệt độ thanh trùng (0C) gồm 4 mức nhiệt độ.
A1 = 50 A2 = 60 A3 = 70 A4 = 80
Nhân tố B: Thời gian thanh trùng (phút) gồm 3 mức thời gian.
B1 = 20 B2 = 25 B3 = 30
Mẫu đối chứng: Dung dịch nha đam không thanh trùng.
Bảng 3.1: Bảng phân bố mẫu thí nghiệm 1
Nhân tố A (0C) Nhân tố B (phút)
B1 B2 B3
A1 A1B1 A1B2 A1B3
A2 A2B1 A2B2 A2B3
A3 A3B1 A3B2 A3B3
A4 A4B1 A4B2 A4B3
Ứng với mỗi nghiệm thức là một mẫu thí nghiệm. Tổng số nghiệm thức: 4 x 3 + 1 = 13 nghiệm thức
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 20
Chuẩn bị môi trƣờng, nƣớc muối sinh lý 0,9% và các dụng cụ nuôi cấy nhƣ: đĩa petri, đầu col, ống nghiệm,... tất cả đƣợc tiệt trùng ở 121 0
C trong 20 phút. Tiệt trùng tủ cấy vi sinh bằng cồn và tia UV.
Mẫu nha đam đƣợc rửa sơ bộ, gọt vỏ, rồi rửa sạch. Tiến hành bổ sung nƣớc để trích ly (tỉ lệ trích ly nha đam : nƣớc là 1:1), sau đó, xay nhuyễn bằng máy xay rồi đem lọc bằng vải lọc để loại bỏ bã, thu đƣợc dịch nha đam. Dịch nha đam thu đƣợc cho vào bình tam giác, dùng giấy nhôm bịt kín. Tiến hành thanh trùng ở các mức nhiệt độ, thời gian khảo sát và làm nguội nhanh.
Lấy 1 ml mỗi mẫu dịch nha đam sau khi làm nguội cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc muối sinh lý, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí (pha dung dịch đến nồng độ 10-2, 10-3, 10-4).
Dùng micropipet hút mỗi mẫu pha loãng 1 ml dung dịch và cấy vào đĩa petri, sau đó đổ khoảng 15 ml môi trƣờng PCA (50-60 0
C) vào đĩa và lắc đều. Mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.
Đợi môi trƣờng đông đặc, tiến hành lật ngƣợc đĩa và ủ ở 37 0
C.
Đọc kết quả: sau 24 giờ ủ, đếm tất cả những khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa petri để xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trên mẫu.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định mật số vi sinh vật hiếu khí trong dịch nha đam bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc.
3.3.2. Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ xoài và nấm mốc từ chanh - Mục đích: - Mục đích:
Tạo nguồn vi khuẩn, nấm mốc cho thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch nha đam.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ mẫu xoài và chanh với các bƣớc xử lý, cấy mẫu, quan sát sự phát triển khuẩn lạc, cấy chuyền và bảo quản. Thí nghiệm đƣợc lặp lại nhiều lần đến khi quan sát thấy đƣợc sự đồng nhất về hình dạng và màu sắc vi khuẩn và nấm mốc.
- Tiến hành thí nghiệm:
Pha môi trƣờng PCA, môi trƣờng Sabouraud, chuẩn bị đĩa petri, cây gắp, que cấy,... đem tất cả tiệt trùng ở 121 0C trong 20 phút. Sau khi tiệt trùng tiến hành rót đĩa (15 ml môi trƣờng/ 1 đĩa), để môi trƣờng đông đặc tự nhiên.
Xử lý mẫu xoài: Xoài chín rửa sạch, gọt vỏ, cắt thành miếng (các thao tác đƣợc thực hiện trong điều kiện sạch).
Xử lý mẫu chanh: Chanh sau thời bảo quản ở điều kiện thƣờng (khoảng 2 tuần) xuất hiện nấm mốc.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 21
Đối với mẫu xoài, phân lập trên môi trƣờng PCA, dùng cây gắp gắp từng miếng xoài đặt lên đĩa môi trƣờng đã đông đặc. Đem ủ ở 37 0C. Sau 24 giờ đến 48 giờ, quan sát sự hình thành khuẩn lạc.
Đối với mẫu chanh, phân lập trên môi trƣờng Sabouraud, sử dụng cây gắp nhọn, gắp từng mẫu chanh đã xuất hiện nấm mốc đặt lên môi trƣờng nuôi cấy đã đông đặc. Đậy nắp đĩa, bịt kín, để ở nhiệt độ phòng (25-29 0C). Sau 24 giờ đến 48 giờ, quan sát sự phát triển của nấm mốc.
Từ các quần thể vi sinh vật mọc trên môi trƣờng dinh dƣỡng, tiến hành cấy chuyền bằng phƣơng pháp cấy ria để đƣợc các dòng thuần trên môi trƣờng PCA và Sabouraud.
Bảo quản giống: Chuẩn bị môi trƣờng thạch nghiêng, rót môi trƣờng vào ống nghiệm (1/3 thể tích ống nghiệm) dùng nắp đậy kín, đem hấp tiệt trùng ở 121 0C trong 20 phút, sau đó đặt nghiêng ống nghiệm khi còn nóng cho tới khi môi trƣờng đặc lại. Sử dụng que cấy cấy dòng vi khuẩn thuần, nấm mốc vào ống nghiệm, bịt kín miệng ống nghiệm tránh để nhiễm các vi sinh vật từ bên ngoài. Ủ ở tủ ủ vi sinh, sau 24 giờ quan sát sự phát triển khuẩn lạc, đem bảo quản ở nhiệt độ mát (4 0C).
- Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát sự hình thành và phát triển về hình dạng và màu sắc khuẩn lạc trên môi trƣờng PCA, nấm mốc trên môi trƣờng Sabouraud.
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của dịch nha đam trên vi khuẩn và nấm mốc đã đƣợc phân lập nha đam trên vi khuẩn và nấm mốc đã đƣợc phân lập
3.3.3.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch nha đam trên môi trường PCA
- Mục đích:
Xác định khả năng kháng khuẩn của các mẫu nha đam sau khi xử lý ở nhiệt độ và thời gian khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí với nhân tố là nhiệt độ và thời gian thanh trùng dịch nha đam sau khi trích ly đã đƣợc chọn từ thí nghiệm 1, với các mẫu ở nhiệt độ 60
0C, 70 0C, 80 0C trong thời gian 20 phút, 25 phút, 30 phút. Mẫu đối chứng: nƣớc cất.
- Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trƣờng PCA sau khi đƣợc pha và hấp tiệt trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và mặt thật phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm, thể tích môi trƣờng 15 ml/ đĩa. Để nguội đĩa trong tủ cấy.
Dịch vi khuẩn: Trên mặt thạch vi khuẩn, dùng que cấy đã đƣợc tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch NaCl 0,9% (đã đƣợc hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút), lắc đều ống nghiệm bằng máy trộn vortex để vi khuẩn phân bố đều trong dung dịch.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 22
Trải vi khuẩn: Dùng micropipet hút 100 µl dịch vi khuẩn bơm vào mỗi đĩa môi trƣờng đã đặc. Sau đó dùng que cấy trang vô khuẩn, trang đều trên mặt thạch sao cho vi khuẩn khuếch tán đầy và đều lên mặt thạch, trang cho đến khi mặt thạch khô.
Vòng kháng khuẩn: Sử dụng giấy lọc cắt thành vòng tròn đều có đƣờng kính 6 mm, tiệt trùng, sấy khô vòng kháng khuẩn rồi cho từng vòng kháng khuẩn vào mỗi bình tam giác chứa dịch nha đam đã thanh trùng ở các chế độ khác nhau.
Dùng gắp nhọn gắp từng vòng kháng khuẩn trong mỗi mẫu nha đam đặt lên đĩa petri đã trải khuẩn lạc, mỗi đĩa đặt 3 vòng kháng khuẩn, mỗi chế độ thanh trùng dịch nha đam đặt 2 đĩa. Để yên 15 phút cho vòng kháng khuẩn khô. Bao kín đĩa thạch đã cấy, lật ngƣợc đĩa sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37 0C, quan sát sau 24 giờ.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát và đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn sau 24 giờ cấy, xác định mẫu nha đam có nhiệt độ và thời gian thanh trùng có đƣờng kính vòng kháng khuẩn cao nhất.
3.3.3.2. Khảo sát khả năng kháng nấm của dịch nha đam trên môi trường Sabouraud
- Mục đích:
Xác định khả năng kháng nấm của dịch nha đam ở các chế độ xử lý với các thể tích khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố.
Nhân tố C: Mẫu nha đam với nhiệt độ (0C) và thời gian (phút) thanh trùng khác nhau đƣợc chọn từ thí nghiệm 1.
C1: 60-20 C4: 70-20 C7: 80-20
C2: 60-25 C5: 70-25 C8: 80-25
C3: 60-30 C6: 70-30 C9: 80-30
Nhân tố D: Thể tích dịch nha đam/ thể tích môi trƣờng. D1: 1 ml/ 15 ml
D2: 2 ml/ 15 ml D3: 3 ml/ 15 ml
Mẫu đối chứng: Môi trƣờng Sabouraud nuôi cấy nấm bình thƣờng không có dịch nha đam.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 23
Bảng 3.2: Bảng phân bố mẫu thí nghiệm 3
Nhân tố C Nhân tố D D1 D2 D3 C1 C1D1 C1D2 C1D3 C2 C2D1 C2D2 C2D3 C3 C3D1 C3D2 C3D3 C4 C4D1 C4D2 C4D3 C5 C5D1 C5D2 C5D3 C6 C6D1 C6D2 C6D3 C7 C7D1 C7D2 C7D3 C8 C8D1 C8D2 C8D3 C9 C9D1 C9D2 C9D3 - Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị môi trƣờng: Pha môi trƣờng Sabouraud và hấp tiệt trùng ở 121 0C trong 20 phút.
Sử dụng micropipet hút mỗi bình tam giác dịch nha đam đã thanh trùng theo thể tích 1 ml, 2 ml, 3 ml bơm vào đĩa petri. Sau đó đỗ vào mỗi đĩa petri 15 ml môi trƣờng Saubouraud (50 0C), lắc đều, để đĩa nguội và đông đặc trong tủ cấy.
Dùng ống kim loại khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, đục lỗ thạch tròn đƣờng kính 6 mm trên đĩa petri phân lập nấm mốc. Chuyển phần thạch nấm vào đĩa petri vừa pha dịch nha đam và môi trƣờng Sabouraud đã đông đặc, mỗi đĩa cấy 3 lỗ thạch. Bịt kín đĩa, đặt đĩa ở nhiệt độ 25-29 0C. Theo dõi sự phát triển của lỗ thạch nấm sau 24 giờ.
- Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát và đo đƣờng kính lỗ thạch nấm mốc trên môi trƣờng nuôi cấy có thể tích dịch nha đam ở các chế độ thanh trùng khác nhau. Xác định mẫu nha đam với nồng độ có khả năng kháng nấm cao nhất .
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 24
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRONG CÁC MẪU NHA ĐAM SAU KHI THANH TRÙNG CÁC MẪU NHA ĐAM SAU KHI THANH TRÙNG
Bảng 4.1: Kết quả xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong các mẫu nha đam thanh trùng theo nhiệt độ và thời gian
Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Trung bình
nghiệm thức 20 25 30 Đối chứng 2.104 2.104c 50 6,6.103 4,8.103 3,9.103 5,1.103b 60 2,6.103 1,5.103 1,1.103 1,7.103a 70 1,2.103 1,1.103 8,4.102 1,1.103a 80 8,2.102 6,6.102 5,2.102 6,7.102a Trung bình nghiệm thức 6,2.10 3a 5,6.103a 5,3.103a
(Các giá trị có các chữ cái khác nhau trên cùng một cột và một hàng biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%)
Nhận xét:
Dịch nha đam trong quá trình xử lý sẽ dễ bị nhiễm vi sinh vật, gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời, hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm của dịch. Vì vậy, cần áp dụng một biện pháp an toàn để đảm bảo vi sinh cho dịch sau khi trích ly, đồng thời không làm mất hoạt tính của các hoạt chất có tính kháng trong dịch nha đam.
Thanh trùng là một phƣơng pháp sử dụng nhiệt ở một khoảng thời gian cần thiết để tiêu diệt các vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm đến một mức độ cho phép. Sự giảm số lƣợng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm sau quá trình thanh trùng là một vấn đề cần quan tâm. Khi nâng nhiệt độ môi trƣờng quá nhiệt độ tối thích của vi sinh vật thì hoạt động của chúng bị chậm lại. Ở nhiệt độ cao, protein của nguyên sinh chất của vi sinh vật bị đông tụ làm cho vi sinh vật bị chết. Quá trình đông tụ protein này không thuận nghịch, nên hoạt động của vi sinh vật không phục hồi sau khi hạ nhiệt (Lê Mỹ Hồng, Bùi Hữu Thuận, 2000). Nhiệt độ càng cao và thời gian giữ nhiệt càng dài thì khả năng tiêu diệt vi sinh vật càng lớn, tuy nhiên chất lƣợng sản phẩm có thể giảm. Do vậy, cần chọn chế độ thanh trùng hợp lý.
Kết quả trung bình ở bảng 4.1 cho thấy, tổng số vi sinh vật hiếu khí ở các mẫu nha đam khi thanh trùng ở nhiệt độ 50 0C, 60 0C, 70 0C, 80 0C có sự khác biệt ý nghĩa lớn so với mẫu nha đam đối chứng (mẫu không qua chế độ thanh trùng). Tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong dịch nha đam giảm dần khi nhiệt độ thanh trùng tăng từ 50 0C đến 80 0C và thời gian từ 20 phút đến 30 phút. Ở chế độ thanh trùng 50 0C vi sinh vật tổng số phát triển còn nhiều, có sự khác biệt ý nghĩa thống kê so với ở 60
0C, 70 0C, 80 0C. Do đó, nghiên cứu không tiếp tục khảo sát ở mức nhiệt độ thanh trùng 50 0C. Còn ở các chế độ thanh trùng 60 0C, 70 0C, 80 0C trong thời gian 20 phút, 25 phút và 30 phút không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 25
Vậy, qua quá trình xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong các mẫu nha đam cho thấy, để có đƣợc dịch nha đam sau khi xử lý đảm bảo về vi sinh vật tổng số, đồng thời vẫn đạt hiệu quả về khả năng kháng khuẩn và kháng nấm nên tiếp tục tiến hành khảo sát các thí nghiệm tiếp theo ở 3 mức nhiệt độ thanh trùng 60 0C, 70
0C, 80 0C trong thời gian 20 phút, 25 phút và 30 phút.
4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ XOÀI VÀ NẤM MỐC TỪ CHANH CHANH
Việc phân lập giống vi khuẩn và nấm mốc là một phần quan trọng của đề tài, để tạo nguồn vi khuẩn và nấm mốc dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch nha đam.
Kết quả tiến trình phân lập:
Giống vi khuẩn đƣợc tiến hành phân lập từ mẫu xoài trên môi trƣờng PCA.
Mẫu xoài đƣợc rửa sạch, gọt vỏ, cắt thành miếng nhỏ. Dùng gắp chuyển từng miếng xoài lên môi trƣờng PCA. Ủ mẫu ở 37 0C trong 24 giờ.
Hình 4.1: Mẫu xoài nguyên liệu
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 26
Quan sát sự phát triển, hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc, tiến hành đánh dấu và ký hiệu phân loại để chọn những khuẩn lạc có tốc độ phát triển mạnh, hình dạng và màu sắc giống nhau rồi dùng que cấy vòng, khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chuyển cả phần khuẩn lạc sang môi trƣờng PCA mới bằng phƣơng pháp cấy ria.
Sau khi cấy đƣợc dòng thuần vi khuẩn, tiến hành cấy vào môi trƣờng thạch nghiêng để bảo quản.
Giống nấm mốc đƣợc tiến hành phân lập từ mẫu chanh trên môi trƣờng Sabouraud.
Mẫu chanh tƣơi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng trong phòng thí nghiệm đến khi xuất hiện đốm nấm màu xám, xanh.
Hình 4.4: Khuẩn lạc cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng để bảo quản Hình 4.3: Môi trƣờng PCA sau khi đƣợc cấy ria
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm 27
Chuẩn bị môi trƣờng Sabouraud, đổ vào đĩa petri 15 ml môi trƣờng, để môi