CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ tương ứng từng nhiệt độ
Quá trinh sinh tổng hợp enzyme phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào nấm mốc nên thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quan trọng quyết định hoạt tính của enzyme. Nhiệt độ nuôi cấy cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy và khả năng sinh enzyme của vi sinh vật. Do đó, thí nghiệm được tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy nấm mốc
A.niger (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) ở các nhiệt độ khác nhau (28°c, 31°c, 34°c, 37°C) nhằm tìm ra thời điểm và nhiệt độ mà nấm mốc phát triển tối ưu cho hiệu quả sinh tổng họp protease có hoạt tính cao. Kết quả đo hoạt tính protease thay đổi theo thời gian ủ và nhiệt độ được tổng hợp ở bảng 4.4.
Dựa vào kết quả ở bảng 4.4 nhận thấy, hoạt tính protease có sự khác biệt đáng kể ở các mức thời gian khác nhau khi tiến hành nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau. Nhìn chung, hoạt tính của enzyme thu được đều tăng dần khi thời gian ủ kéo dài đến 72 giờ ở các mức nhiệt độ khác nhau 28°c, 31°c, 34°c, 37°c. Tuy nhiên, hoạt tính bắt đầu giảm khi thời gian nuôi cấy tăng từ 72 giờ đến 120 giờ. Hoạt tính enzyme thu được
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - xviii -
Bảng 4.4: Sự thay đỗi hoạt tính protease theo thòi gian ủ ở các nhiệt độ khác nhau
Thời gian ủ (giờ) 28°c 31°c 34°c 37°c
24 0,015a± 0,006 0,045a ± 0,001 0,036a ± 0,003 0,026a ± 0,003
48 0,060b± 0,005 0,062b ± 0,009 0,048a ± 0,019 0,04 Ia ± 0,00172 0,109c± 0,010 0,126d± 0,012 0,780b ± 0,021 0,730b ± 0,006 72 0,109c± 0,010 0,126d± 0,012 0,780b ± 0,021 0,730b ± 0,006
96 0,080b± 0,009 0,085c + 0,010 0,055ab + 0,006 0,05 lab + 0,002
120 0,067b± 0,011 0,069b + 0,002 0,048a + 0,002 0,044a + 0,001
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ỷ nghĩa thống kê theo phép kiểm định LSD ở độ tin cậy 95%
liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của tế bào nấm mốc. Trong 24 giờ sau khi cấy, nấm mốc A. niger đang dần thích nghi với điều kiện môi trường nên chưa gia tăng mật số đáng kể. Vì thế, việc thu chế phẩm enzyme ở thời điểm này là quá sớm khiến cho enzyme chưa được tổng hợp nhiều, protease thu được có hoạt tính khá thấp so với các thời gian khác ở cùng nhiệt độ. Hoạt tính thu được ở nhiệt độ 28°c, 31°c, 34°c, 37°c chỉ đạt lần lượt là 0,018 ± 0,006 u/g, 0,045 ± 0,001 u/g, 0,036 ± 0,003 u/g và 0,026 ± 0,003 u/g. Sau 24 giờ nuôi cấy, nấm mốc bắt đầu gia tăng mật số, thúc đẩy sự tổng họp protease, hoạt tính của enzyme gia tăng (Patil et al., 2006).
Thời gian để nấm mốc phát triển tối ưu, sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao nhất là 72 giờ nuôi ủ, tương ứng với hoạt tính protease thu được là 0,109 ± 0,010 u/g ở 28°c ,
0,126 ± 0,012 u/g ở 31°c , 0,780 ± 0,021 u/g ở 34°c và ở 37°c là 0,730 ± 0,006 u/g. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Karuna và Ayyana (1993); Ikasari và Mitchell (1994) trên dòng Rhizopus oligosporus. Samamtarn et al. (1999) cũng tìm thấy thời gian ủ tối ưu giúp thu nhận protease khi tiến hành nuôi cấy A. oryzae UI521 là 72 giờ. Ikram
et al. (2006) cũng nói rằng thời gian ủ 72 giờ là tối ưu cho sản xuất protease từ Penicillỉum chrysogenum.
Sau thời gian ủ tối ưu (trường hợp khảo sát là 72 giờ), môi trường sẽ cạn dần chất dinh dưỡng, quá trình tăng trưởng của nấm mốc giảm dần, kéo theo sự sinh tổng hợp enzyme hầu như ngừng lại nên hoạt tính enzyme thu được thấp (Grebechova et al., 2007). Nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy, thì hoạt tính protease sẽ giảm xuống. Như vậy, thời gian ủ nấm mốc thích hợp nhất nhằm thu được protease có hoạt tính cao là 72 giờ trong điều kiện nhiệt độ trong khoảng từ 28"K34°C trong điều kiện nuôi cấy trên bề mặt ở môi trường SSF.
4.4.2 Xác định nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men sinh tổng hợp protease từ A. niger ở thời gian tối ưu (72 giờ)