CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.2.2 Phươngpháp phân tích và đo đạc kết quả
i. Nguyên tắc:
Phương pháp Ason (Anson, 1938) sử dụng casein là cơ chất phản ứng, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt
tính protease theo định nghĩa. Hoạt tính của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 mL dung dịch hay 1 mg chế phẩm protease trong thời gian 1 phút ở điều kiện chuẩn (30°c, pH 7,6).
ii. Phương pháp tiến hành
Các chỉ tiêu theo dõi trong khảo sát được tổng họp trong bảng 3.1 Bảng 3.1: Phương pháp và thiết bị sử dụng để phân tích các chỉ tiêu
TT Chỉ tiêu Phương pháp [1] Độ âm nguyên
liệu (%)
Sấy ở nhiệt độ 105°c đến khối lượng không đổi (AOAC 934.06)
[2] Mật sô nâm mốc (cfu/mL)
Đếm khuẩn lạc nấm mốc (cfu/mL) khi ủ trên môi trường Sabouround (Lê Thị Thanh Mai et al., 2009)
[3] Sự hao hụt khôi lượng
Xác định băng cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g
[4] Hoạt tính protease
Phương pháp Anson cải tiên (Anson, 1938)
[5] Điêu chỉnh pH môi trường
Điêu chỉnh băng dung dịch đệm ở các mức pH khảo sát. Sử dụng pH kế theo tiêu chuẩn ISO 2917 : 1999 (E)
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống mẫu, 3 ống đối chứng. Cách thực hiện đo hàm lượng tyrosine của mẫu được tiến hành theo Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Phương pháp xác định lượng tyrosine trong mẫu
Trong đó:
- Dung dịch Na2HP04 1/15 M: hòa tan 5,9690 g Na2HP04.12H20 trong nước vừa đủ 250 mL.
- Dung dịch KH2PO4 1/15 M : hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước đến vừa đủ 100 mL.
- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 mL dung dịch Na2HP041/15M với 11,5 mL dung dịch KH2P04 1/15M đến khi pH đạt 7,6.
- Dung dịch casein 1%: pha lg Casein ữong 100 mL dung dịch đệm Sorensen. - Dung dịch TCA 10%: hòa tan 10 g TCA trong nước cho đủ 100 mL.
- Dung dich NaOH 0,5 N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 mL. - Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:2).
iii. Tính kết quả
Từ kết quả đo OD và phương trình đường chuẩn tyrosine, số |4,mol tyrosine được xác định và tìm ra hoạt tính của protease trong 1 mL dịch trích theo công thức: