CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO
Độ ẩm của môi trường lên men được biết đến là một trong những yếu tố quan trọng nhất có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tổng họp enzyme từ vi sinh vật (Tewari
et al., 2005). Đối với quá trinh nuôi cấy nấm mốc sinh tổng họp các enzyme thủy phân
nói chung và protease nói riêng, việc điều chỉnh độ ẩm môi trường thường được tiến hành với nước cất (Joshi et al., 2006).
Dựa trên các tài liệu tham khảo và các thí nghiệm thăm dò, thí nghiệm điều chỉnh môi trường ở các độ ẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70% được tiến hành. Hoạt tính protease thu nhận tương ứng với các nghiệm thức khảo sát được thể hiện ở bảng 4.2.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - xviii -
nguồn cơ chất trên được tổng họp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Hoạt tính protease thu được từ ba nguồn cơ chất lên men
Nguyên liệu Hoạt tính protease (U/g)
Bột đậu nành 0,086a± 0,008
Bột mì 0,039b± 0,018
Cám gạo 0,053b ± 0,013
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ỷ nghĩa thống kê theo phép kiểm định LSD ở độ tin cậy 95%
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men đến hoạt tính protease từ dòng nấm
Dựa vào kết quả cho thấy, hoạt tính protease ở độ ẩm 55 và 60% không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Độ ẩm môi trường lên men ở 55% và 60% đều thu được enzyme có hoạt tính khá cao (0,091 ± 0,013 u/g ở 55% ẩm và 0,080 ± 0,008 u/g ở 60% ẩm). Tuy nhiên, hoạt tính protease thu được là cao nhất khi điều chỉnh độ ẩm môi trường ở 55%, cao hơn gấp 1,3 lần khi so sánh với mẫu enzyme ở độ ẩm 50% chỉ đạt được 0,069 ± 0,006 u/g.
Qua bảng 4.2, nhận thấy khi độ ẩm càng tăng thì hoạt tính protease thu được càng giảm xuống. Nhìn chung, khi độ ẩm ở 65% hoạt tính thu được là 0,073 ± 0,004 u/g và chỉ còn 0,068 ± 0,009 u/g khi ấm môi trường ở 70%. Điều này có thể được giải thích do nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí, khi độ ẩm quá cao dẫn đến độ thoáng khí trong môi trường giảm dần. Ngược lại, độ ẩm thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng sinh tổng họp enzyme (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010). Srividya Shivakumar (2012) nhận thấy khi tiến hành lên men ở độ ẩm 55% đối với dòng Aspergillus niger var. tieghem cho hoạt tính cao hơn với các độ ầm khác.
Dựa vào kết quả nhận thấy, độ ẩm 55% và 60% đều phù họp với quá trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus niger. Do đó, độ ẩm môi trường ở 55% được chọn để điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp protease cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA pH MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BAN ĐẦU ĐẾN KHẢ
NĂNG THU NHẬN PROTESE TỪ Aspergillus niger
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường lên men lại có ảnh hưởng không nhỏ. Theo Tewari et al. (2005), pH ban đầu của môi trường lên men cũng là một trong
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - xviii -
mốc A. niger s5
Độ ẩm môi trường (%) Hoạt tính protease (U/g)
50 0,069a ± 0,006
55 0,091b± 0,013
60 0,080ab ± 0,008
65 0,073a± 0,004
70 0,068a ± 0,009
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ỷ nghĩa thống kê theo phép kiểm định LSD ở độ tin cậy 95%
những yếu tố quan trọng nhất, có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme từ vi sinh vật. Bên cạnh đó, do nuôi cấy trong bình tam giác nên rất khó để kiểm soát độ pH của môi trường trong quá trình lên men. Chính vì thế, khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến hoạt lực protease tích lũy được tiến hành. Việc điều chỉnh pH môi trường ban đầu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nói chung và protease nói riêng thường được tiến hành với nước cất, có hoặc không có bổ sung NaOH 0,1 N và HC1 0,1 N để điều chỉnh pH (Joshi et al., 2006; Mrudula và Anitharaj, 2011) hoặc sử dụng đệm phosphate (Suresh và Viruthagiri, 2010). Đặc biệt, Khan và Husaini (2006) đã bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của việc điều chinh pH ban đầu của quá trình lên men sinh tổng hợp amylase và cellulase bằng 4 loại đệm acetate, citrate, phosphate và tris HC1.
Dựa trên cơ sở này và các thí nghiệm thăm dò, cũng như điều kiện làm thí nghiệm, việc điều chỉnh pH ban đầu của môi trường lên men được tiến hành tại các giá trị pH: 3, 4, 5,
6, 7, 8 bằng dung dịch đệm citrate - phosphate. Kết quả đo hoạt tính protease khi thay đổi giá trị pH của môi trường lên men được thể hiện ở bảng 4.3.
Dựa vào kết quả cho thấy, hoạt tính protease ở các giá trị pH khảo sát có sự khác biệt ý nghĩa khi so sánh với trường họp mẫu đối chứng khi sử dụng nước cất ở cùng khoảng pH = 6 (chỉ đạt được giá trị 0,091 ±0,013 u/g trong khi hoạt tính protease là 0,118 ± 0,005 khi sử dụng dung dịch đệm citrate - phosphate tại pH = 6).
Nhìn chung, hoạt tính protease thu được khá thấp ở những môi trường ban đầu có pH kiềm tại pH = 7 và 8 (hoạt tính protease chỉ đạt được 0,086 ± 0,013 u/g và 0,049 ± 0,015 u/g). Ngược lại, môi trường ban đầu có pH nằm trong vùng acid cho hoạt tính protese cao hơn và đạt cực đại khi môi trường có pH = 5. Hoạt tính thu được trong trường họp này là 0,127 ± 0,019 u/g. Tại pH = 6, hoạt tính protease cũng tương đối
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - xviii -
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến hoạt tính protease
pH Hoạt tính protease (U/g)
3,0 o o 4,0 0,075b± 0,008 5,0 0,127c± 0,019 6,0 0,118c± 0,005 7,0 0,086b± 0,013 8,0 0,049a ± 0,015 Đối chứng (nước cất pH=6-6,5) 0,09 lb ± 0,013
Các chữ cái khác nhau frong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ỷ nghĩa thống kê theo phép kiểm định LSD ở độ tin cậy 95%
cao (0,118 ± 0,005 u/g). Tuy nhiên, khi tăng độ acid của môi trường thì hoạt tính protease lại có xu hướng giảm. Theo khảo sát của của Irfan et al. (2011) cũng đã cho kết quả tương tự trên cơ chất cám lúa mì. Theo nghiên cứu của Ikramul et al. (2003)
trên dòng Rhizopus oligosporus HIS 13 lại thu nhận kết quả hoạt tính protease cao nhất tại pH = 6. Điều này chứng tỏ, việc sử pH thích hợp còn phụ thuộc vào mỗi loại enzyme, vi sinh vật cũng như nguồn cơ chất khác nhau (Khan và Husaini, 2006). Như vậy, môi trường ban đầu ở pH = 5 là pH tối ưu cho việc sinh tổng họp protease từ Aspergillus niger và được chọn là nhân tố cố định cho thí nghiệm tiếp theo.
4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP
PROTEASE Ở CÁC NHIỆT Độ KHÁC NHAU