IHC)
Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) là phương pháp có ựộ chắnh xác cao, dùng phương pháp này có thể phát hiện ựược virus kháng nguyên tồn tại trong mô bào. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ựược thực hiện dựa trên nguyên lý của sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể ựặc hiệu và ựược phát hiện bằng chất chỉ thị màu. Kết quả ựánh giá mức ựộ nặng nhẹ khác nhau tùy thuộc vào sự xuất hiện các ựiểm, các ựám màu vàng nâu trên tiêu bản. Khi có sự kết hợp giữ kháng nguyên với kháng thể ựơn dòng ựặc hiệu thì xuất hiện các ựám vàng nâu càng nhiều càng ựậm chứng tỏ virus tập chung ở ựó càng nhiều. Phương pháp IHC có quy trình tẩm ựúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể ựã trình bày trong phần 2.6.9).
Sau khi có tiêu bản bệnh phẩm, quá trình nhuộm hóa mô miễn dịch IHC ựược thực hiện qua các bước sau.
*Các bước nhuộm:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hóa enzym
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút.
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30%: 9 Methanol). Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: Gắn kháng thể (KT)
Nhỏ 80ộlKT Care chuẩn/1 tiêu bản để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua ựêm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 37
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/1 tiêu bản để tủ ấm 370C/1h
Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 Ờ 8 phút. Quan sát kết quả.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Haematoxylin (30 giây), làm sạch,
gắn Baume canada lên lamen nhanh trên tiêu bản và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.
2.6.11. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
Thống kê triệu chứng, nhiệt ựộ, số lượng bạch cầu, số lượng kháng thểẦ sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu ựồ biểu diễn tiến triển của bệnh, nhiệt ựộ, số lượng bạch cầu, số lượng kháng thể Ầbằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 38
CHƯƠNG3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng virus Care của chó trước khi gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768)