Tìm thể Lents
Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch cạo niêm mạc mắt hay mũi chó bệnh, ựem nhuộm Hematoxilin Ờ Eosin (HE), tìm tiểu thể Lents qua kắnh hiển vi. Cần chú ý, ở não, thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại (Smith và Martin, 1979).
Chẩn ựoán virus học
Tiêm truyền bệnh phẩm cho ựộng vật thắ nghiệm
Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chó nghi mắc bệnh ựem nghiền, chế thành huyễn dịch và tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm. Ưu tiên sử dụng chồn hoặc chó non, ngoài ra có thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ.
Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên ựộng vật thắ nghiệm, mổ khám bệnh tắch ựại thể và kết luận.
Trong bệnh phẩm có thể phân lập ựược một số vi khuẩn kế phát như
Pasteurella, Bacillus bronchisepticus, Staphylococcus, E. coli và Salmonella.
Phân lập virus trên môi trường tế bào
Mẫu bệnh phẩm ựem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi ựem gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp thắch hợp. Virus Care chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tắch tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp. Bệnh tắch tế bào do CDV gây ra có thể quan sát ựược là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 19 hiện CPE.
Sự xuất hiện nhiều hay ắt, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, ựộc lực của virus và ỘtuổiỢ tế bào. Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào ựã nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs, 2005).
Chẩn ựoán bằng phản ứng miễn dịch ựánh dấu enzym (ELISA)
ELISA(Enzyme linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế kết quả ựặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, có sử dụng kháng thể có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra sự kết hợp ựó (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009).
Chẩn ựoán bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp có ựộ chắnh xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức. Phương pháp này ựược thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể ựặc hiệu và ựược phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn Hữu Nam và cs., 2011).
Chẩn ựoán phát hiện RNA của virus Care bằng RT- PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác.
Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt ựộng trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau ựó, cDNA này sẽ ựược khuếch ựại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác ựịnh bệnh là sản phẩm nhân bản một ựoạn gen ựặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm này ựược nhận biết qua ựiện di trên gel agarose (Lan và cs, 2008).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 20
Chẩn ựoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn ựoán nhanh
Hiện nay, nhiều phòng khám thú y sử dụng phương pháp xét nghiệm nhanh bằng thiết bị thiết kế sẵn, ựơn giản, tiện dụng và có ựộ chắnh xác cao.
Phản ứng xảy ra với nguyên tắc là có hai kháng thể ựơn dòng chuẩn kết hợp với kháng nguyên cần phát hiện, gọi là kỹ thuật sandwich trực tiếp. Kháng thể chuẩn ựơn dòng thứ nhất ựược gắn sẵn vào ựáy giếng của bộ kắt.
− Sau ựó kháng nguyên cần phát hiện ựược phủ lên, cuối cùng là phủ conjugate - kháng thể ựặc hiệu cùng với loại kháng thể ựơn dòng ựầu tiên gắn ở ựáy giếng có gắn Enzym và chất hiện màu.
− Nếu kháng nguyên ựặc hiệu với kháng thể sẽ có sự kết hợp với phức hợp kháng nguyên kháng thể, tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên Ờ kháng thể, trong giếng hốn dịch có Enzyme ựể giải phóng [O2] từ [H2O] oxy hóa chất hiện màu làm thay ựổi màu kết quả trên test thử sẽ xuất hiện hai vạch tại vị trắ Control (C) và tại test (T) khi ựó phản ứng là dương tắnh.
− Nếu kháng nguyên không ựặc hiệu với kháng thể, sẽ không có sự kết hợp kháng nguyên Ờ kháng thể và kháng thể bị rửa trôi, tiếp ựó Conjugate không kết hợp với phức kháng nguyên Ờ kháng thể cũng bị rửa trôi hỗn dịch sẽ không có Enzyme ựể giải phóng O2từ H2O và chất hiện màu không bị oxy hóa, phản ứng âm tắnh với sự xuất hiện chỉ một vạch tại C (tài liệu ựi kèm theo test thử nơi sản xuất Ờ Nhật Bản).
Ưu ựiểm của thiết bị này là có ựộ nhạy cao, có thể chẩn ựoán bệnh sớm trong thời gian ựầu của bệnh, khi mà các triệu chứng lâm sàng chưa thể hiện rõ. Mặt khác biện pháp này dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết tương, huyết thanh, dịch kết mạc mắt và nước mũi. đọc kết quả phản ứng sau 5 - 10 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 21
Hình 1.2. Kắt chẩn ựoán nhanh bệnh Care
Hình 1.3. Khi chó mắc bệnh Care kắt lên hai vạch
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});