- Bệnh cảm mạo: ở giai ựoạn ựầu.
- Bệnh viêm phổi: Chó thường mắc khi thời tiết thay ựổi, gió mua ựông lạnh, mắc ở tất cả các lưa tuổi
Ớ Chó sốt cao, khó thở thở khò khè
Ớ điều trị bằng kháng sinh ựặc hiệu bệnh ở ựường hô hấp sau 5-7 ngày bệnh giảm và khỏi, chó chở lại bình thường.
- Bệnh tiêu chảy: Do nhiễm khuẩn hay ăn thức ăn không vệ sinh Ớ Chó có thể sốt (do nhiễm khuẩn) hoặc không sốt
Ớ Ỉa chảy không có máu
Ớđiều trị bằng kháng sịnh ựặc hiệu cùng bổ sung nước và càc chất ựiện giải, sau 7-10 ngày bênh sẽ giảm rồi dần khỏi.
- Bệnh do parvovirus và viêm gan do virus ở chó:
ỚGiống nhau ựều có triệu chứng tiêu chảy, mùi phân tanh khắm ỚKhác nhau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 22
Bệnh do Parvovirus: Phân loãng như nước, mỗi lần ựi ỉa số lượng phân nhiều.
Bệnh viêm gan do virus:
- Phân thành khuôn nhưng phân sống - Bụng chướng to do gan sưng, báng nước
- Niên mạc mắt viêm nặng hơn Care, trong giống như cùi nhãn. Bệnh dại ở chó với biểu hiên thần kinh:
ỚBệnh Care thường xuất hiện các triệu chứng thần kinh ở giai ựoạn cuối của bệnh...còn giai ựoạn ựầu của bệnh biểu hiện không rõ. Nên chó khỏi bệnh thường có biểu hiện ựần ựộn.
ỚBệnh dại: chó biểu hiện rõ ở các giai ựoạn khác nhau. - Có thể phân biệt bằng cách lấy não làm tiêu bản (bệnh dại)
- Lấy tế bào biểu (cere) ựể phát hiện thể: Nêgri ở bênh dại, Lentz ở bệnh Care.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 23
CHƯƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. đối tượng nghiên cứu
Chủng virus Care (CDV-768), giống chó lai Becgie 2 tháng tuổi.
2.2. địa ựiểm nghiên cứu
- Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm công nghệ sinh học Thú Y. - Phòng thắ nghiệm bộ môn Bệnh lý Thú y.
- Khu nuôi ựộng vật thắ nghiệm của Khoa Thú Y Ờ Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 07/2013 ựến tháng 11/2014.
2.4. Nội dung nghiên cứu
-Gây bệnh thực nghiệm cho chó bằng chủng virus Care (CDV-768). -Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng, chỉ tiêu huyết học của chó ựược gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768).
-Nghiên cứu một số bệnh tắch ựại thể, bệnh tắch vi thể ở cơ quan tổ chức của chó ựược gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768).
-Nghiên cứu sự phân bố của chủng virus Care (CDV-768) trong các cơ quan của chó ựược gây bệnh thực nghiệm.
2.5. Nguyên liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.1. Virus
Virus sử dụng là chủng virus Care (CDV-768), ựược phân lập từ chó mắc bệnh Care tại ựịa bàn Hà Nội. Chó này có biểu hiện chó kém ăn, sốt 40 Ờ 410C, ủ rũ, mệt mỏi... Ngoài ra còn có hiện tượng, tiêu chảy, thở khó, có nốt sài và có triệu chứng thần kinh. Virus ựược nuôi cấy, phân lập trên dòng tế bào VERO - DST tại Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm công nghệ sinh học Thú y ựạt hiệu giá virus là 106 TCID50/ml.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 24
2.5.2. động vật thắ nghiệm
động vật thắ nghiệm gồm 5 con, chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 4- 5 kg/con.
Chó thắ nghiệm ựược chọn là chó không mắc virus Care và các virus khác(bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan chó....)và không có kháng thể kháng virus Care.
2.5.3. Hoá chất
-Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy DMEM, FSB, kháng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS....
-Hóa chất sử dụng cho phản ứng RT-PCR: Kắt tách chiết ARN (QIAamp), Nuclease free water, dNTP, enzym, primers, TBE, agarose....
-Hoá chất sử dụng làm tiêu bản vi thể: formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, buncanada Ầ
-Kháng thể chuẩn (Fluorescent Isothicocynat Ờ Dako - Denmark) Và các hóa chất khác cần thiết phục vụ cho nghiên cứu.
2.5.4. Máy móc và dụng cụ
-Tủ lạnh, tủ ấm 370C, tủ sấy, buồng cấy vô trùng.
-Máy móc sử dụng cho làm tiêu bản vi thể: lọ chứa formol 10%, máy chuyển mẫu tự ựộng (Microm STP 120 - đức), máy ựúc (Microm Ap 280), máy cắt Microton (Microm HM315 -đức), máy sấy, kắnh hiển vi thường (Carl Zeiss Microlmaging GmbH 37081 Gotting En, VMI 0189 - đức), Ầ
-Máy cắt Microton, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy ựiện di, máy chụp ảnh gel, máy ựọc kết quả ELISA (Elx808 Biotek), kắnh hiện vi quang học.
-Các dụng cụ khác gồm: lam kắnh,kắnh hiển vi, bình nuôi cấy tế bào, ống eppendoft, pipet, găng tayẦ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 25
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
Bố trắ thắ nghiệm: thắ nghiệm chia làm 2 lô: Lô thắ nghiệm 3 con.
Lô ựối chứng 2 con.
Chó thắ nghiệm và ựối chứng ựược nuôi tại khu nuôi ựộng vật thắ nghiệm ựạt tiêu chuẩn về ựiều kiện chăm sóc nuôi dưỡng vệ sinh an toàn sinh học thú y.
Trước khi gây nhiễm, tiến hành theo dõi tình trạng sức khỏe của chó trong 7 ngày với các chỉ tiêu: nhiệt ựộ, tình trạng ăn uống, biểu hiện lâm sàng. 5 chó ựược lấy máu ựể kiểm tra các chỉ tiêu huyết học vào ngày bắt về và ngày thứ 7, ựồng thời xét nghiệm sự có mặt của virus Care và một số virus khác như bệnh Pavovirus, Lepto, viêm gan chó và bệnh dại bằng phương pháp RT-PCR.
đối với 3 con chó thắ nghiệm ựược gây nhiễm 2ml chủng virus Care (CDV-768) liều 106TCID50/25ộl qua niêm mạc mắt, khắ dung và miệng. Trong vòng 21 ngày kể từ ngày gây nhiễm, cứ 2 ngày chúng tôi tiến hành lấy máu, lấy phân và dịch swabs 1 lần ựể kiểm tra sự có mặt của virus. 2 con chó ựối chứng khôngựược tiêm virus Care.
Sau khi gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768) nếu chó có biểu hiện triệu chứng sốt cao, bỏ ăn, có dử mắt mũi, ỉa chảy cho ựến khi chó chết hoặc chó có triệu chứng ựiện hình của bệnh Care thì tiến hành mổ khám, kiểm tra bệnh tắch ựại thể, làm tiêu bản bệnh lý quan sát bệnh tắch vi thể, làm hóa mô miễn dịch xem sự phân bố virus ở các cơ quan trong cơ thể.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 26
2.6.2. Theo dõi triệu chứng lâm sàng của chó ựược gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768) Care (CDV-768)
Triệu chứng lâm sàng của chó nghi mắc bệnh Care ựược xác ựịnh thông qua theo dõi, quan sát và ghi chép ựầy ựủ từ bước bắt ựầu nuôi chó, sau khi gây nhiễm cho ựến khi chó có triệu chứng bệnh ựiển hìnhhoặc chết. đồng thời chúng tôi theo dõi chó lô ựối chứng ựể so sánh với chó lô thắ nghiệm.
2.6.3. Phương pháp phân lâp virus trên môi trường tế bào Vero-DST
Virus Care có khả năng nhân lên và phân hủy tế bào Vero-DST, sau 36 giờ, 72 giờ nuôi cấy, quan sát bệnh tắch tế bào (Cytopathogenic Effect) ựể ựánh giá sự nhân lên của virus. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp phân lập ựược tiến hành như sau:
+ Chuẩn bị tế bào: nuôi cấy tế bào Vero-DST trong khay 96 giếng.
Cho khay vào tủ ấm 370C có 5% CO2. Quan sát tế bào hàng ngày ựến khi tế bào mọc thành một lớp thì gây nhiễm bệnh phẩm nghi có virus Care ựã ựược chuẩn bị sẵn.
+ Chuẩn bị mẫu phân lập
- Mẫu bệnh phẩm nghi có virus Care sau khi lấy ựược bảo quản trong tủ lạnh -800C.
- Khi cần phân lập, bệnh phẩm ựược ựồng nhất trong môi trường DMEM có bổ sung thành phần kháng sinh (tỷ lệ 1:10).
- Ly tâm huyễn dịch, bỏ cặn và pha loãng theo cơ số 2 ựể gây nhiễm vào môi trường tế bào.
- Mỗi giếng gây nhiễm 25ộl dung dịch. Mỗi mẫu bệnh phẩm gây nhiễm trên 3 giếng.
- đĩa nuôi cấy ựược ựặt trong tủ ấm 370C có 5% CO2.
- Quan sát CPE trên khay nuôi cấy sau 36 giờ; 48 giờ và 72 giờ. Sau khi gây nhiễm virus.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 27 - Khi xuất hiện CPE (90%) thì thu virus, bảo quản trong tủ -800C ựến khi cần sử dụng.
2.6.4. Phương pháp ELISA
Các bước thực hiện phản ứng ELISA:
Bước 1: để hóa chất ở nhiệt ựộ phòng trước khi sử dụng ắt nhất một giờ.
Bước 2: Pha mẫu trong dung dịch pha loãng (dilution) với tỷ lệ: 1:100.
Bước 3: Nhỏ 100 ộl ựối chứng dương và ựối chứng âm vào hai giếng khác nhau. Nhỏ 100 ộl mẫu ựã pha loãng trong dilution vào các giếng và ủ ở nhiệt ựộ phòng trong vòng 10 phút.
Bước 4: Rửa 4 lần bằng dung dịch washing solution (washing solution ựược pha trong nước khử ion với tỷ lệ 1/10)
Bước 5: Nhỏ 100ộl, conjugate vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt ựộ phòng 10 phút
Bước 6: Làm giống bước 4
Bước 7: Nhỏ 100ộl substrate solution vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút
Bước 8: Nhỏ 100ộl stop solution vào mỗi giếng.
Bước 9: đo bước sóng bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 450 nm trong 5 phút sau khi nhỏ stop solution.
đọc kết quả:
Phản ứng ựạt yêu cầu khi: OD ựối chứng dương >1 OD ựối chứng âm < 0,2
Cách tắnh kết quả: cut off = OD ựối chứng dương x 0,2 OD mẫu > cut off: mẫu dương tắnh OD mẫu <cut off: mẫu âm tắnh
2.6.5. Kiểm tra virus học
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 28 ba, ruột, não... ựược bao gói cẩn thận ựảm bảo không lây lan mầm bệnh ra bên ngoài môi trường và ựược bảo quản trong ựiều kiện lạnh rồi chuyển tới Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm công nghệ sinh học Thú y càng sớm càng tốt (trong vòng 24 giờ). Tại phòng thắ nghiệm mẫu sẽ ựược xử lý và bảo quản ở nhiệt ựộ âm sâu (-800C). đến khi sử dụng cho phân lập virus.
Ớ Máy móc, dụng cụ, môi trường, hóa chất, nguyên liệu - Máy móc: + Tủ ấm 370C CO2 5% + Bình chứa Nitơ lỏng + Tủ lạnh + Máy ly tâm + Buồng cấy
+ Kắnh hiển vi soi nổi - Dụng cụ:
+ Pipet + đầu tip (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chai nuôi tế bào + Ống eppendorf + Găng tay
- Môi trường, hóa chất, nguyên liệu
+ Môi trường DMEM (DulbeccoỖs Minimum Essential Medium) + Tế bào Vero
+ Trypsin-EDTA
2.6.6. Phương pháp RT-PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 29 PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác.
Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt ựộng trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau ựó, cDNA này sẽ ựược khuếch ựại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác ựịnh bệnh là sản phẩm nhân bản một ựoạn gen ựặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm này ựược nhận biết qua ựiện di trên gel agarose (Lan và cs, 2008).
Trước tiên cần phân lập virus, mẫu bệnh phẩm (2g) ựược nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau ựó ựược ựồng nhất trong dung dịch DMEM.
2.6.6.1. Phương pháp tách chiết RNA.
Bước 1: Cho 560ộl Buffer AVL vào ống eppendorf 1,5ml.
Bước 2:Cho 140ộl mẫu vào ống trên. Votex trong 15 giây, ựể nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn.
Bước 3: Bổ sung 560ộl Ethanol (96%-100%) vào ống và votex trong 15 giây.
Bước 4: Hút 630ộl mẫu trong ống vào cột QIA ựậy nắp và ly tâm 13000 vòng/75 giây, loại bỏ dung dịch phắa dưới cột, lặp lại bước 4 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 5:Cho 500ộl AW1 vào cột QIA, ly tâm 13000 vòng/75 giây, loại bỏ dịch phắa dưới cột.
Bước 6: Cho 500ộl AW2 vào cột QIA, ly tâm 14000 vòng/3 phút, loại bỏ dịch phắa dưới cột, ly tâm lại lần nữa 14000 vòng/75 giây.
Bước 7:đặt cột QIA vào ống eppendoft 1,5 ml mới, thêm 60ộl AVE ủ nhiệt ựộ phòng trong 1 phút, ly tâm 13000 vòng/75 giây.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 30
2.6.6.2. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần phản ứng ựược trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl)
2X Reaction Mix 12,5
Mẫu RNA 5,0
Primer Forward 0,5
Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tắch 25
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR (Lan NT và cs, 2007) Mồi xuôi: ATG TTT ATG ATC ACA GCG CGG T
Mồi ngược:ATT GGG TTG CAC CAC TTG TC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt ựược trình bày ở bảng sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 60 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
điện di kiểm tra sản phẩm PCR
2.6.6.3. Phương pháp ựiện di
- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 1X, ựun sôi trong lò vi song, ựể nguội ựến khoảng 400C, ựổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ựiện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR. - Chuẩn bị bể ựiện di: Chuyển thạch ựã ựông vào bể ựiện di, thêm TBE
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 31 1X ựến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR vào các giếng với thể tắch 5ộl marker và 10ộl sản phẩm PCR mỗi giếng.
- điện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
- Quan sát kết quả ựiện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
2.6.7. Phương pháp quan sát, mô tả
Theo dõi hàng ngày: ựo thân nhiệt, quan sát và ghi chép các biểu hiện lâm sàng.
2.6.8. Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tắch ựại thể của chó ựược gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768) gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768)
- Mổ khám xoang ngực
Trước tiên lột bỏ hết cơ ngực, sau ựó dùng kéo cắt xương cắt một ựường bắt ựầu từ xương sườn thứ nhất ựến ựầu của xương sườn cuối cùng, rồi cắt rời xương ức ra khỏi cơ hoành, màng ngăn ngực và bao tim. Kiểm tra các vị trắ và mặt ngoài các cơ quan xoang ngực: trạng thái tim, trạng thái phổi và các bộ phận liên quan ựến màng tim và phổi.
- Các khắ quan vùng cổ
Rạch một ựường thẳng từ mõm ựến vùng ngực, mở da ra hai bên, kiểm tra niêm mạc dưới da và tuyến nước bọt: Vị trắ, trọng lượng của tuyếnẦ.. Kiểm tra sâu hơn nữa là hạch dưới hàm. Dùng tay và dao rạch từ từ lấy lưỡi ra ngoài kiểm tra lưỡi, hạch amidal, hầu và thực quảnẦ
- Mổ khám xoang bụng
Rạch một ựường thẳng bên trái từ mõm xương kiếm xuống ựến sát hậu môn. Cắt từng lớp da ở bụng và các tổ chức liên kết ra. Nếu bụng chướng to thì phải lấy ngón tay hoặc vật cùn làm thủ màng bụng, luồn ngửa hai ngón tay
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 32 trỏ và ngón giữa của tay trái vào xoang bụng, tay phải cầm ngửa lưỡi dao luồn vào kẽ hai ngón tay trái ựó rồi vạch vách màng bụng theo hướng từ trên xuống dưới. Như vậy tránh ựược làm rách dạ dày và ruột. Kiểm tra các cơ quan ở xoang bụng:
Kiểm tra: lách, gan,dạ dày, ruột, thận và tuyến thượng thận, . . . - Các khắ quan vùng xoang chậu
Khắ quan sinh dục ựực: bao dịch hoàn, âm nang, qui ựầu, niệu ựạoẦ Khắ quan sinh dục cái: tương mạc từ cung, màng cheo và tổ chức liên