Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 29 PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khó có thể phát hiện bằng phương pháp khác.
Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt ựộng trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau ựó, cDNA này sẽ ựược khuếch ựại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác ựịnh bệnh là sản phẩm nhân bản một ựoạn gen ựặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm này ựược nhận biết qua ựiện di trên gel agarose (Lan và cs, 2008).
Trước tiên cần phân lập virus, mẫu bệnh phẩm (2g) ựược nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau ựó ựược ựồng nhất trong dung dịch DMEM.
2.6.6.1. Phương pháp tách chiết RNA.
Bước 1: Cho 560ộl Buffer AVL vào ống eppendorf 1,5ml.
Bước 2:Cho 140ộl mẫu vào ống trên. Votex trong 15 giây, ựể nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn.
Bước 3: Bổ sung 560ộl Ethanol (96%-100%) vào ống và votex trong 15 giây.
Bước 4: Hút 630ộl mẫu trong ống vào cột QIA ựậy nắp và ly tâm 13000 vòng/75 giây, loại bỏ dung dịch phắa dưới cột, lặp lại bước 4 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 5:Cho 500ộl AW1 vào cột QIA, ly tâm 13000 vòng/75 giây, loại bỏ dịch phắa dưới cột.
Bước 6: Cho 500ộl AW2 vào cột QIA, ly tâm 14000 vòng/3 phút, loại bỏ dịch phắa dưới cột, ly tâm lại lần nữa 14000 vòng/75 giây.
Bước 7:đặt cột QIA vào ống eppendoft 1,5 ml mới, thêm 60ộl AVE ủ nhiệt ựộ phòng trong 1 phút, ly tâm 13000 vòng/75 giây.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 30
2.6.6.2. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần phản ứng ựược trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl)
2X Reaction Mix 12,5
Mẫu RNA 5,0
Primer Forward 0,5
Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tắch 25
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR (Lan NT và cs, 2007) Mồi xuôi: ATG TTT ATG ATC ACA GCG CGG T
Mồi ngược:ATT GGG TTG CAC CAC TTG TC
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt ựược trình bày ở bảng sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 60 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
điện di kiểm tra sản phẩm PCR
2.6.6.3. Phương pháp ựiện di
- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 1X, ựun sôi trong lò vi song, ựể nguội ựến khoảng 400C, ựổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ựiện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR. - Chuẩn bị bể ựiện di: Chuyển thạch ựã ựông vào bể ựiện di, thêm TBE
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kinh tế Page 31 1X ựến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR vào các giếng với thể tắch 5ộl marker và 10ộl sản phẩm PCR mỗi giếng.
- điện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
- Quan sát kết quả ựiện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.