5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Tính toán hiệu lực của chế phẩm trong phòng thí nghiệm theo công thức Abbott và ngoài đồng ruộng theo công thức Henderson - Tilton.
- Xử lý thống kê số liệu thu thập được qua điều tra, thí nghiệm bằng phần mềm Excel, Irristat 4.0 vàStatistix 8.2
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu phân lập tạo thực liệu virút NPV sâu khoang
3.1.1. Thuthập, phân lập sâu khoang nhiễm bệnh ngoài tự nhiên
Để có nguồn vi rút có hoạt lực cao, chúng tôi đã tiến hành điều tra tình hình phát sinh gây chết sâu khoang của các tác nhân bệnh. Đồng thời thu thập nguồn thực liệu sâu khoang hại bị nhiễm bệnh NPV ngoài đồng ruộng. Tiến hành thu sâu khoang hại trên bắp cải, đậu tương và khoai sọ, trong đó số
lượngsâu khoang có triệu chứng chết do nhiễm NPV trên khoai sọ thu được nhiều nhất, còn trên bắp cải đậu tương ít hơn.
Bảng 3. 1. Tỷ lệ sâu khoang nhiễm NPV trên các cây trồng qua các kỳđiều tra (Hà Nội, 2013)
TT Cây trồng Địa điểm bSệốnh NPV mẫu bị Tỷ lNPV(%) ệ sâu nhiễm
1 Bắp cải Đông Anh 3 42,86
2 Đậu tương Mê Linh 3 37,50
3 Khoai sọ Từ Liêm 6 50,00
Tổng số - 12 -
Kết quả điều tra (bảng 3.1) cho thấy ngoài đồng ruộng, sâu khoang thường bị nhiễm và chết do NPV có tỷ lệ cao nhất ở trên cây khoai sọ đạt 50,00%, vì đây là cây trồng ít phun thuốc nên số lượng quần thể sâu hại cao và các tác nhân gây bệnh thể hiện rõ rệt hơn. Còn trên cây bắp cải thì tỷ lệ sâu khoang bị chết cũng đạt 42,86%, mặc dù nông dân sử dụng thuốc hóa học để
phòng trừ sâu hại với số lần phun khá nhiều.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
thể sâu chết căng mọng, treo mình dưới lá cây được chọn lọc riêng để tiến hành phân lập. Qua xác định đã thu được 12 mẫu sâu nhiễm vi rút điển hìnhtrên 3 loại cây trồng khác nhau. Bao gồm: 3 mẫu sâu khoang trên bắp cải, 3 mẫu trên đậu tương và 6 mẫu trên khoai sọ (bảng 3.1).
3.1.2. Phân lập và chọn lọc nguồn thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao 3.1.2.1. Hiệu lực của các nguồn thực liệu vi rút NPV thu ngoài đồng 3.1.2.1. Hiệu lực của các nguồn thực liệu vi rút NPV thu ngoài đồng
Từ kết quảđiều tra thu thập các mẫu sâu khoang bị nhiễm và chết do các tác nhân gây bệnh thì không phải hầu hết các cá thể sâu chết có triệu chứng
đặc trưng của NPV. Điều đó, càng cho thấy việc phân lập, làm thuần tạo nguồn thực liệu NPV là rất cần thiết đối với quá trình phát triển chế phẩm sau này.
Các mẫu sâu khoang bị bệnh thu được từđồng ruộng của cùng một loại cây được xử lý qua cồn 50 độ, rồi chovào ống effendorf ngâm nước cất hai lần. Sau 10 ngày tiến hành ly tâm trong dung dịch Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) 0,1% xen kẽ với 2 lần nước cất để phân lập thể vùi vi rút NPV. Sau đó, thu lại phần thể vùi và kiểm tra đếm số lượng thể vùi cho mỗi nhóm sâu nhiễm bệnh trên kính hiển vi.
Tiến hành sử dụng thể vùi thu được từ các nguồn lây nhiễm đánh giá trên sâu non sâu khoang nuôi nhân bằng thức ăn sạch. Qua đánh giá khả năng hình thành thể vùi và hiệu quả gây chết sâu khoang từ 3 nguồn thực liệu vi rút NPV thu được trên bắp cải, đậu tương và khoai sọ, kết quả (bảng 3.2) cho thấy hoạt lực và khả năng sinh thể vùi của các nguồn NPV thu được rất khác nhau giữa các nguồn thực liệu thu thập ngoài đồng ruộng.
Với nguồn sâu bị bệnh NPV thu trên bắp cải có hàm lượng thể vùi cao nhất đạt tới 2,7 x 108 OB/ml và hoạt lực gây chết sâu cũng cao nhất, tới 69,33%. Còn nguồn thực liệu thu từ ruộng đậu tương và khoai sọ có số thể vùi và khả năng gây chết sâuthấphơn, số liệu tương ứng là 1,3 x 108 OB/ml và
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
51,33% trên đậu tương, chỉ đạt1,0 x 108 OB/ml và 42,67% trên khoai sọ
(bảng 3.2).
Bảng 3. 2. Hiệu lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của các nguồn thực liệu vi rút đã thu thập (Viện BVTV, 2013)
Ký hiệu mẫu Địa điểm thu thập Cây trồng Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi hình thành từ sâu chết (OB/ml) M1 Đông Anh Bắp cải 69,33 c 2,7 x 108 c M2 Mê Linh Đậu tương 51,33 b 1,3 x 108 b M3 Từ Liêm Khoai sọ 42,67 a 1,0 x 108 a
Ghi chú: a, b, c là thể hiện sự sai khác có ý nghĩa ở mức 95%
Hình 3. 1. Thể vùi NPV phân lập từ sâu khoang bị bệnh ngoài đồng
Để chọn lọc được các nguồn thực liệu vi rút NPV thuần, có hoạt lực gây chết sâu và khả năng sinh thể vùi cao để phục vụ sản xuất chế phẩm, đề
tài tiến hành phân lập làm thuần qua các bước.
3.1.2.2. Hiệu lực của các nguồn vi rút NPV qua các lần tuyển chọn
Như Grzywacz, et al. (1996) [23] đã chỉ rõ các nguồn vi rút thu thập và chọn lọc ngay tại vùng sinh thái thường có hiệu quả tốt hơn. Đồng thời, một nguồn vi rút tuyển chọn được coi là có hoạt lực cao phải đảm bảo đồng thời 2 chỉ tiêu quan trọng nhất là:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
1/ Nguồn vi rút NPV có khả năng sinh thể vùi cao
2/ Có hiệu quả gây chết nhanh với mức cao đối với ký chủ của nó.
Dựa theo các tiêu chí như Grzywacz và CS. (1996) [23] đã nêu, chúng tôi tiến hành qua các bước phân lập kết hợp đánh giá hoạt lực của các nguồn vi rút NPV để tuyển chọn dòng vi rút có tiềm năng nhất.
+ Sau phân lập lần 1
Bảng 3. 3. Hiệu lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi sau phân lập lần 1của các nguồn vi rút NPV đã thu được(Viện BVTV, 2013)
Nguồn thực liệu Ngulồựn phân la chọn ập, Tỷ lệ sâu chết 10 NSN (%) Lượng thể vùi hình thành từ sâu chết(OB/ml) M1 M1.1 53,34 1,50 x 108 M 1.2 46,67 1,40x 108 M 1.3 73,33 2,64 x 108 M 1.4 70,00 3,0 x 108 M2 M 2.1 68,00 1,87 x 108 M 2.2 60,00 1,80 x 108 M 2.3 43,34 1,56 x 108 M3 M 3.1 33,34 1,50 x 108 M 3.2 66,67 1,75 x 108 M 3.3 56,67 1,50 x 108 M 3.4 26,67 1,2 x 108 M 3.5 73,33 2,0 x 108 M 3.6 63,33 2,0 x 108
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
Sau khi nhiễm các nguồn trên sâu khoang khỏe, kết quả (bảng 3.3) cho thấy hàm lượng thể vùi và hoạt lực gây chết sâu của các chủng rất khác nhau.
Đã thu được 7 chủng có mật độ thể vùi cao đạt từ 1,75- 3,0 x 108 OB/ml. Kết quả thu được ở bảng 3.3 cũng cho thấy hiệu lực gây chết sâu của các mẫu M1, M2 và M3 đạt từ 66,67- 73,33% và khả năng sinh thể vùi đạt từ 1,8- 3,0 x 108 OB/ml.
Trong sốđó:
- Từ nguồn mẫu M1 thu được 2 nguồn phân lập có tiềm năng, gồm M1.3 có hoạt lực gây chết sâu đạt tới 73,33% và hàm lượng thể vùi đạt 2,64 x 108 OB/ml ; nguồn phân lập M1.4 với chỉ tiêu tương ứng là 70,0% và 3,0 x 108 OB/ml.
- Từ nguồn mẫu M2 lựa chọn được 1 nguồn là M2.1 với hoạt lực gây chết sâu khoang đạt cao nhất chỉ đạt 68,0% và hàm lượng thể vùi đạt 1,87 x 108 OB/ml.
- Từ nguồn mẫu M.3 thu được nguồn M3.5 với các chỉ tiêu tương ứng
đạt 73,33% và 2,0 x 108 OB/ml (bảng 3.3).
Như vậy sau lần phân lập 1 và qua đánh giá theo dõi thu được 4 nguồn phân lập có tiềm năng cao, trong đó nguồn M1 lựa chọn được 2 nguồn phân lập là M1.3 và M1.4, nguồn M2 tuyển chọn được 1 nguồn phân lập là M2.1 và từ nguồn M3 tuyển chọn được nguồn phân lập M3.5. Các nguồn NPV điển hình này được chọn ra để tiến hành phân lập, tuyển chọn trong chu kỳ thí nghiệm tiếp theo.
+ Sau phân lập lần 2
Tiếp tục phân lập kết hợp đánh giá hoạt lực của 4 nguồn vi rút NPV đã
được lựa chọn sau lần phân lập 1trên sâu sạch bệnh được nuôi nhân trong phòng thí nghiệm.Các chủng được chọn để phân lập với nguồnM1 bao gồm M 1.3, M 1.4; với nguồnM2 bao gồm M 2.1; với nguồn M3 làM 3.5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 • Kết quả phân lập, đánh giá vớinguồn M1
Tiến hành phân lập kết hợp đánh giá hoạt lực của 2 nguồn M1.3 và M1.4 đã chọn được 14 nguồn vi rút NPV điển hình (bảng 3.4). Kết quả cho thấy hàm lượng thể vùi và hoạt lực gây chết sâu khoang rất khác nhau, với hàm lượng thể
vùi đạt từ 1,6- 2,8x 108 OB/ml và tỷ lệ sâu chết qua đánh giá đạt từ 42,50- 78,00 %.
Bảng 3. 4.Hiệu lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1sau phân lập lần 2(Viện BVTV, 2013)
Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) M 1.3.2 72,50 1,50 x 108 M 1.4.1 52,50 1,60 x 108 M 1.3.5 52,50 2,50 x 108 M 1.4.4 50,00 1,50x 108 M 1.3.6 77,50 2,58 x 108 M 1.4.5 42,50 1,50 x 108 M 1.3.9 70,00 1,90 x 108 M 1.4.10 77,50 1,60 x 108 M 1.3.11 76,00 2,40 x 108 M 1.4.11 70,00 1,55 x 108 M 1.3.14 70,00 2,00x 108 M 1.4.13 57,50 1,60 x 108 M 1.3.15 57,50 1,60 x 108 M 1.4.14 78,00 2,80 x 108
Qua đánh giá đã xác định được 4 dòng phân lậpcó tiềm năng cao là M1.3.6; M1.3.11; M1.4.10 và M1.4.14. Trong số đó, nguồn phân lập M1.3.6 với khả
năng sinh thể vùi đạt 2,58x 108 OB/ml và hoạt lực gây chết sâu đạt 77,5%, nguồn phân lập M1.3.11 với các chỉ tiêu đạt tương ứng là 2,4x 108 OB/ml và 76,0%. Với nguồn vi rút M1.4 tuyển chọn được nguồn phân lập M1.4.10 có hàm lượng thể vùi đạt 1,6x 108 OB/ml và hoạt lực gây chết sâu khoang đạt 77,5%, nguồn phân lập M1.4.14 với các chỉ tiêu tương ứng là 2,8x 108 OB/ml và 78,0 %.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 • Kết quả phân lập, đánh giá vớinguồnM2
Tiến hành phân lập kết hợp đánh giá nguồn vi rút M2.1 đã được tuyển chọn sau lần phân lập lần 1. Kết quả trình bày ở bảng 3.5.
Qua theo dõi đã lựa chọn được 6 nguồn phân lập có tiềm năng từ
nguồnM2.1với hàm lượng thể vùi đạt từ 1,50- 2,50 x 108OB/ml và tỷ lệ sâu chết qua đánh giá đạt từ62,80- 74,29%.
Bảng 3. 5.Hiệu lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2sau phân lập lần 2(Viện BVTV, 2013) STT Nguồn phân lập tuyển chọn Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) 1 M2.1.3 67,14 2,50 x 108 2 M2.1.4 62,80 1,50 x 108 3 M2.1.7 57,14 1,75 x 108 4 M2.1.10 51,43 1,58 x 108 5 M2.1.13 42,86 2,55x 108 6 M2.1.15 74,29 1,50x 108
Trong số các nguồn phân lập có tiềm năng, có nguồn M2.1.15 thể hiện tiềm năng nổi bật nhất với khả năng sinh thể vùi đạt 1,50x 108OB/mlvà hoạt lực gây chết sâu non sâu khoang đạt 74,29%. Tuy nhiên, có nguồn phân lập có tiềm năng sinh thể vùi rất cao, như M2.1.3 và M2.1.13 đã đạt tới 2,5 và 2,55 x 108OB/ml nhưng hoạt lực gây chết sâu chỉ đạt mức thấp, tương ứng là 67,14 và 42,86%. Những nguồn thực liệu này vẫn được lưu giữ để phục vụ cho các nghiên cứu sau này.
Như vậy, với nguồn M2.1đã tuyển chọn được 1nguồn phân lập có hàm lượng thể vùi và hiệu lực gây chết sâu cao làM2.1.15.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 • Kết quả phân lập, đánh giá vớinguồnM3
Tiến hành phân lập tiếpnguồn vi rútM3.5 đã được tuyển chọn sau lần phân lập lần 1. Kết quả sau phân lập tuyển chọn lần 2 trình bày qua bảng 3.6 cho thấy có9 nguồn phân lập điển hình từ nguồn M3.5với mật độ thể vùi từ
1,0–2,57 x 108 OB/ml và có hoạt lực gây chết sâu non sâu khoang đạt từ 26,67- 71,2%.
Bảng 3. 6.Hiệu lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3 sau phân lập lần 2(Viện BVTV, 2013)
STT Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml)
1 M3.5.3 34,29 1,50x 108 2 M3.5.6 70,00 2,50x 108 3 M3.5.7 26,67 1,00x 108 4 M3.5.8 53,33 1,00x 108 5 M3.5.11 26,67 1,42x 108 6 M3.5.12 66,67 1,83x 108 7 M3.5.13 65,00 2,00x 108 8 M3.5.15 43,34 1,35x 108 9 M3.5.17 71,20 2,57x 108
Trong 9 nguồn phân lập điển hình đã tuyển chọn được, qua đánh giá cho thấy chỉ có 2 nguồn phân lập thể hiện tiềm năng cao là M3.5.6 và M3.5.17. Nguồn phân lập M3.5.17 có tiềm năng cao nhất với khả năng sinh thể vùi đạt 2,57 x 108 OB/ml và hiệu lực gây chết sâu khoang đạt tới71,2%, còn nguồn phân lập M3.5.6 cũng thể hiện tiềm năng rõ rệt nhưng ở mức thập hơn với các chỉ tiêu tương ứng là 2,5x 108OB/ml và hiệu lực gây chết sâu khoang
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 đạt70,0%. Cả 2 nguồn vi rút này được tuyển chọn để tiếp tục các chu kỳ phân
lập tiếp theo.
Như vậy, sau phân lập lần 2, qua đánh giá đã tuyển chọn được tổng số 6 nguồn phân lập có tiềm năng cao là M1.3.6; M1.3.11; M1.4.10 và M1.4.14 từ
nguồn thực liệu ban đầu là M1, một nguồn M2.1.15 từ thực liệu M2và 2 nguồn phân lập gồm M3.5.6 và M3.5.17 từ thực liệu M3.
+ Sau phân lập lần 3
• Kết quả phân lập, đánh giá vớinguồnM1
Tiếp tục phân lập và đánh giá lần 3 với4dòng phân lập từ nguồn thực liệu ban đầu M1.Kết quả trình bày trong bảng 3.7 cho thấy đã xác định được 3 nguồn phân lập có tiềm năng cao với hàm lượng thể vùi đạt từ 1,0- 5,0x 108 OB/ml và hoạt lực gây chết sâu đạt từ 26,53- 83,67 %.
Bảng 3. 7.Hiệu lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1 sau phân lập lần 3(Viện BVTV, 2013) Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) M 1.3.6.3 83,67 3,5 x 108 M 1.4.10.12 43,75 1,0 x 108 M 1.3.6.5 43,75 2,0 x 108 M 1.4.14.2 83,33 5,0 x 108 M 1.3.6.8 69,39 3,5 x 108 M 1.4.14.3 24,49 2,0 x 108 M 1.3.6.10 38,78 1,80 x 108 M 1.4.14.4 50,00 1,5 x 108 M 1.3.11.3 72,0 4,0 x 108 M 1.4.14.6 26,53 2,5 x 108 M 1.3.11.4 32,65 2,0 x 108 M 1.4.14.8 70,83 2,85 x 108 M 1.3.11.9 75,51 3,5 x 108 M 1.4.14.10 40,82 2,0 x 108 M 1.4.10.7 22,45 1,35 x 108 M 1.4.14.9 47,92 1,60 x 108 M 1.4.10.11 32,65 2,5 x 108
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Qua đánh giá đã xác định được 3 dòng phân lập điển hình có tiềm năng cao
được tuyển chọn là M1.3.6.3; M1.3.11.9 và M1.4.14.2với có hàm lượng thể vùi tương ứng đạt 3,5; 3,5 và 5,0x 108 OB/ml và hoạt lực gây chết sâuđạt tương ứng là 83.67; 75,51 và83,33%.
Trong số 3 nguồn phân lập được tuyển chọn nói trên, nhận thấy nguồn phân lập mã số M1.4.14.2 thể hiện tiềm năng toàn diện hơn, kể cả khả năng sinh thể vùi đạt tới 5,0x 108 OB/ml và hoạt lực gây chết sâuđạt tới 83.33% (bảng 3.7).
• Kết quả phân lập, đánh giá với nguồnM2
Bảng 3. 8. Hiệu lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2sau phân lập lần 3(Viện BVTV, 2013) Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) Nguồn phân lập Tỷ lệ chết (%) Lượng thể vùi (OB/ml) M2.1.15.1 57,14 1,35 x 108 M2.1.15.8 31,25 1,56 x 108 M2.1.15.2 50,0 1,55 x 108 M2.1.15.11 70,83 1,87x 108 M2.1.15.3 42,86 1,60 x 108 M2.1.15.12 73,47 3,50 x 108 M2.1.15.5 79,17 2,15 x 108 M2.1.15.13 58,33 2,45 x 108 M2.1.15.6 59,18 1,54x 108 M2.1.15.14 64,58 1,65 x 108 M2.1.15.7 38,78 1,55 x 108 M2.1.15.17 71,43 1,85 x 108
Tiến hành phân lập và đánh giá các chủng vi rút phân lập có nguồn gốc từM2.1.15 sau khi được lựa chọn sau phân lập lần 2. Kết quả đã xác định
được 12 nguồn mẫu điển hình và qua phân tích cóhàm lượng thể vùi ở các chủng đạt từ 1,35- 3,50 x 108 OB/ml và hiệu lực gây chết sâu đạt từ 38,78- 79,17 % (bảng 3.8).
Trong số đó, có 2 nguồn phân lập điển hình và có tiềm năng cao là M2.1.15.5 và M2.1.15.12, có khả năng sinh thể vùi đạt chỉ số tương ứng là