5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang lực cao trong gây chết sâu khoang
Tiến hành điều tra thu thập các nguồn NPV gây chết sâu hại ngoài tự
nhiên vào các cao điểm sâu hại phát sinh trên hành tỏi, rau thập tự và lạc tại các vùng nông nghiệp quanh Hà Nội và một số vùng khác theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật (Viện Bảo vệ thực vật, (1997) [11], (2000) [12].
Đặc biệt là các vùng có nguồn NPV tự nhiên có tiềm năng độc tính cao như
Hải Dương, Đông Anh, Sơn Tây. Dựa vào các triệu chứng đặc trưng của sâu khoang khi bị nhiễm bệnh nói chung và NPV nói riêng để thu thập mẫu sâu nhiễm bệnh. Sau đó đem về phòng thí nghiệm tiến hành phân nhóm nguồn sâu theo triệu chứng bên ngoài và lưu giữở nhiệt độ 2- 40C.
Đồng thời, tiến hành nuôi nhân sẵn số lượng lớn sâu khoang sạch trong phòng thí nghiệm. Sau đó, tiến hành nghiền và lọc riêng rẽ cho từng mẫu sâu nhiễm bệnh để lấy dịch phẩm. Sử dụng dịch phẩm nhiễm trên 50- 100 cá thể
sâu khỏe đã chuẩn bị sẵn theo phương pháp nhiễm thức ăn để nhân và kết hợp tách lọc sơ khởi nguồn NPV theo triệu chứng nhiễm bệnh của sâu. Việc nhân thực liệu nguồn kết hợp tinh lọc tiến hành nhiều lần cho tới khi các cá thể sâu nhiễm từ cùng nguồn NPV có triệu chứng đặc trưng giống nhau.
Các nguồn thực liệu NPV được thu thập trên sâu khoang hại rau, lạc và đậu tương nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng sẽ được phân lập theo phương pháp như các tác giả Grzywacz,et al. (1996) [23]
+ Thí nghiệm 1: Thu thập và phân lập vi rút NPV từ các mẫu sâu khoang nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng, tiến hành qua các bước sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
- Đưa về phòng nghiền lọc và ly tâm trong dung dịch SDS 0,1%.
- Ly tâm để tách SDS và thay bằng dung dịch sucarose nồng độ 65% để
phân lập vi rút NPV.
- Phân lập vi rút từ vật chủ trong đó vi rút kí sinh là một bước quan trọng nghiên cứu chẩn đoán bệnh hoặc cho mục đích đặc biệt cần đến độ tinh khiết cao của hạt vi rút. Phương pháp phân lập gồm các bước sau:
Thu mẫu côn trùng bị bệnh cho vào cối, cho nước cất nước khử ion 2 lần hoặc đệm Tris, pH 7,3 – 8,0, nghiền, lọc bỏ bã. Lấy dịch lọc li tâm 500 vòng/ phút trong 5 phút, bỏ cặn, lấy dịch ly tâm (hình2.1):
Mỗi nguồn sâu thu được có triệu chứng đặc trưng của sâu nhiễm NPV sẽ được tiến hành phân lập để đánh giá hàm lượng thể vùi (OB) của nguồn thực liệu đó. Thí nghiệm phân lập làm thuần vi rút được tiến hành qua 3-4 chu
Dịch ly tâm Cặn Lấy cặn màu trắng (thể vùi) ↓ Li tâm 2500vòng/phút trong 15 phút d H2O ↓ Li tâm 10.000 vòng/phút trong 60 phút + Xác định thể vùi bằng kính hiển vi điện tử
+ Đếm số lượng thể vùi bằng kính hiển vi thường
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
kỳ nhân. Trong mỗi lần phân lập, đều tiến hành đánh giá hoạt lực gây chết sâu non sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm, với số lượng 50 cá thể sâu.
Sau khi phân lập được vi rút NPV thu được từ sâu khoang nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng, tiến hành nhiễm ngược trở lại sâu khỏe để kiểm tra mức nhiễm bệnh và thu vi rút NPV. Theo dõi hàm lượng thể vùi và tỷ lệ sâu chết sau các ngày nhiễm vi rút trên sâu.
Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch thể vùi sâu khi đã được phân lập rồi pha loãng từ 2- 3 lần tùy theo hàm lượng thể vùi nhiều hay ít. Sau đó nhuộm màu bằng Tryphan Blue và kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Đếm số lượng thể vùi có trong 5 ô nhỏ rồi tính trung bình.
Sau đótính hàm lượng tế bào theo công thức như sau: Hàm lượng thể vùi (OB/ml) = (a x 4000 x 1000)/H
Trong đó:
a: số thể vùi trung bình có trong 1 ô nhỏ ( V=1/4000mm2) H: hệ số pha loãng
+ Thí nghiệm 2: Phân lập, làm thuần và tuyển chọn nguồn vi rút NPV sâu khoang
Từ nguồn thực liệu vi rút sâu khoang thu được từđồng ruộng, tiếp tục tiến hành phân lập, làm thuần kết hợp lựa chọn các nguồn NPV có hoạt lực cao trên sâu khoang khỏe. Phương pháp phân lập, đánh giá được thực hiện theo phương pháp của Grzywacz,et al. (1996) [23].
Việcphân lập làm thuần kết hợp tuyển chọn lần thứ 1 bằng cách nhiễm vi rút trên sâu khỏe được nuôi bằng thức ăn sạchngay từ sau khi trứng nở để
lựa chọn nguồn thực liệu vi rut NPV có hoạt lực cao và khả năng sinh thể vùi lớn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
nguồn thực liệu thu từ ngoài đồng và đối chứng. Cụ thể:
CT1: Thể vùi tinh của nguồn vi rút M1 được phân lập sau khi nhiễm trên sâu khỏe
CT2: Thể vùi tinh của nguồn vi rút M2 được phân lậpsau khi nhiễm trên sâu khỏe
CT3: Thể vùi tinh của nguồn vi rút M3 được phân lậpsau khi nhiễm trên sâu khỏe
CT4:Đối chứng không nhiễm vi rút NPV
Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc là 50 con sâu khoang khỏe, sau mỗi lần nhắc lại thu 5 sâu chết do NPV đểđếm số lượng thể vùi.
Các bước kỹ thuật để thu hồi thể vùi tinh được tiến hành như sau:
- Cho mẫu sâu khoang chết vào ống nghiệm có chứa 1- 1,5 ml dung dịch SDS 0,1% và nước cất đã được khử trùng
- Nghiền mẫu bằng chày nhỏ và làm tan đều trong 1-2 phút, ly tâm với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 3- 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu phần phần lắng cặn và bổ sung 5ml SDS 0,1% - Có thể tiến hành lặp lại bằng cách hút phần dịch chuyển sang 1 ống
nghiệm mới và loại bỏ phần bã xác của sâu.
- Ly tâm phần dịch nổi ở 2.500 vòng/phút trong 5 phút để thu phần lắng
đọng màu trắng đục là thể vùi vi rút NPV
- Sau đó, tiếp tục bổ sung 1,5ml nước cất 2 lần. Rồi ly tâm với tốc độ
5.000 vòng/phút trong 5 phút, rồi loại bỏ phần dịch nổi, thu phần lắng
đọng thể vùi của vi rút. Bổ sung nước cất 2 lần và lặp lại bước trên một lần nữa.
Sau 3 ngày, 7 ngày và 10 ngày tiến hành theo dõi tỷ lệ chết của các nguồn vi rút và đánh giá hàm lượng thể vùi thu được của mỗi cá thể sâu non. Từ đó, lựa chọn được nguồn thực liệu vi rút có hoạt lực trừ sâu cao và khả
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
năng sinh thể vùi nhiều nhất. Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi đã
được trình bày ở thí nghiệm 1.
+ Thí nghiệm 3: Tiếp tục đánh giá hoạt lực gây chết và khả năng sinh thể vùi của các nguồn vi rút NPV trong các lần phân lập tiếp theo
Thí nghiệm được tiến hành qua 2 bước:
Bước 1: Tiếp tục phân lập và đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang của các nguồn NPV qua các bước tuyển chọn
Thí nghiệm đánh giá và tuyển chọn các nguồn NPV lần 1, lần 2, lần 3 và lựa chọn các mẫu sâu nhiễm vi rút NPV điển hình để tiếp tục phân lập trên sâu sạch được nuôi nhân trong phòng thí nghiệm. Sau đó lây nhiễm vi rút NPV trên sâu khỏe bằng cách phun dung dịch có chứa thể vùi vi rút trên trên thức ăn sạch để sâu ăn. Nồng độ vi rút nhiễm là 1,50 x 108 OB/ml.
Thí nghiệm được tiến hành với 3 nguồn vi rút NPV, mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là 50 sâu khoang khỏe.
Sau 3 ngày, 7 ngày và 10 ngày nhiễm vi rút, thu hàm lượng thể vùi và tính hiệu lực gây chết đối với sâu khoang của các nguồn vi rút.
Bước 2: Đánh giá hoạt lực gây chết sâu khoang của các nguồn vi rút sau tuyển chọn
Sau khi được phân lập ở bước 1, lựa chọn những nguồn vi rút NPV có tiềm năng nhấtđể tiến hành đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang và khả
năng sinh thể vùi bằng cách lây nhiễm trên sâu khoang khỏe nuôi bằng thức
ăn sạch.Thí nghiệm tiến hành với 4 công thức:
Công thức 1: Nhiễm thể vùi tinh của nguồn vi rút TL1 trên sâu khoang khỏe Công thức 2: Nhiễm thể vùi tinh của nguồn vi rút TL2 trên sâu khoang khỏe Công thức 3: Nhiễm thể vùi tinh của nguồn vi rút TL3 trên sâu khoang khỏe Công thức 4: Đối chứng không nhiễm vi rút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
khỏe.Nồng độ vi rút nhiễm là 1,50 x 108 OB/ml.
Sau 3 ngày, 7 ngày và 10 ngày nhiễm vi rút, xác định tỷ lệ sâu chết và hàm lượng thể vùi của mỗi nguồn. Từ đó,chọn ra nguồn vi rút điển hình để
nhiễm trên tế bào sâu khoang.
Sau mỗi lần phân lập chọn ra 5 con sâu khoang đã nhiễm NPV, ngâm trong ống nghiệm. Sau đó, lọc thể vùi tinh, đếm hàm lượng thể vùi và tính toán hiệu lực của nguồn vi rút.
Hoạt lực gây chết sâu khoang được tính theo công thức Abbott: C – T
H(%) = --- x 100 C
Trong đó: C là số sâu sống ở công thức đối chứng T là số sâu sống ở công thức thí nghiệm
2.4.2. Nghiên cứu tạo dạng chế phẩm vi rút NPV từ nguồn vi rút được sản xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi
+ Thí nghiệm 4: Phân lập thể vùi tinh sau khi nhiễm vi rút NPV-Spl trên tế
bào sâu khoang nhân nuôi
Tiến hành lây nhiễm vi rút NPV vào dịch tế bào sâu khoang nuôi nhân trên môi trường Grace‘ s Medium theo chỉ số MOI là 0,1 ở nhiệt độ 270C và pH môi trường nuôi nhân là 7 trong thời gian 4-6 ngày.
Sau đó tiến hành ly tâm 4 lần, lần 1 với tốc độ 500 vòng/phút, lần 2 và 3 với tốc độ 1000 vòng/phút và lần 4 với tốc độ 500 vòng/phút để loại bỏ dịch tế bào và phân lập thể vùi tinh. Nguồn thể vùi tinh được sử dụng để tạo dạng chế phẩm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Tiến hành theo phương pháp tạo dạng bột thấm nước với phụ gia gồm 60% bột tan và 40% bột sét. Phụ gia được nghiền nhỏ mịn với kích thước 0,02- 0,05mm.
Trước hết, đếm số lượng thể vùi tinh và tính toán số lượng thể vùi trong chế phẩm tạo dạng đảm bảo hàm lượng 2 x 109 OB/gam, để sau khi phun với liều lượng 500 gam/ha sẽ có được lượng thể vùi phun rải cho 1 ha cây trồng là 1 x 1012 OB/ha.
Điều chỉnh đảm bảo mức pH từ 6,5- 7,0 và sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ
30- 350C trong thời gian 10- 12 giờ để độ ẩm ở mức 10- 12%. Sau đó, đóng gói trong bao giấy bạc và bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ
từ 5 đến - 50C.
2.4.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV
+ Thí nghiệm 6:Xác định hiệu lực gây chết sâu khoang của chế phẩm trong
điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm tại Viện Bảo vệ thực vật, tiến hành lây nhiễm trên 5 tuổi sâu (tuổi 1 đến tuổi 5) với 4 công thức, 3 lần nhắc lại/ công thức, mỗi lần nhắc lại là 50 sâu khoang, tương ứng với các công thức như sau:
Công thức 1: Liều lượng 300g/ha Công thức 2: Liều lượng 500g/ha Công thức 3: Liều lượng 700g/ha
Đối chứng: Phun nước lã
Theo dõi số sâu sống, sâu chết và tính hiệu lực gây chết sâu khoang của chế phẩm theo công thức Abbott:
C – T
H(%) = --- x 100 C
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
T là số sâu sống ở công thức thí nghiệm
+ Thí nghiệm 7:Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm ngoài
đồng ruộng
Thí nghiệm được tiến hành trên rau bắp cải tại Đông Anh và trên đậu tương tại Từ Liêm. Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức, 3 lần nhắc lại/ công thức. Tiến hành điều tra mật độ sâu khoang trước phun, sau phun và tính hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm theo công thức Henderson – Tilton:
Ta x Cb
H(%) = (1 - --- ) x 100 Tb x Ca
Trong đó: Ta là số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau xử lý Tb là số sâu sống ở công thức thí nghiệm trước xử lý Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng sau xử lý Cb là số sâu sống ở công thức đối chứng trước xử lý