5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.4. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV để phòng trừ sâu hại
Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV sâu hại ở nước ta tập trung nhiều từ năm 1985 đến năm 2002 do 2 cơ quan là Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Bông Nha Hố (nay là Viện nghiên cứu cây bông) tiến hành.
Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV
được khởi xướng với sự giúp đỡ của các chuyên gia Liên Xô (cũ). Sau đó,
được tiến hành với kinh phí đầu tư của chương trình CNSH kế tiếp nhau từ
năm 1996 đến năm 2005 và 01 dự án bằng vốn hỗ trợ của Chương trình Bánh mì thế giới (Cộng hòa Liên bang Đức) giai đoạn 1990- 1995. Các đề tài, dự
án đã thu được nhiều thành tựu to lớn và có giá trị thực tiễn cao đối với công tác bảo vệ thực vật ở Việt Nam. Đã nghiên cứu, xây dựng được qui trình sản xuất thức ăn nhân tạo nuôi sâu.
- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV từ nguồn sâu non nhân nuôi Đã nghiên cứu kỹ thuật tạo dạng sử dụng chế phẩm dưới
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
dạng bột thấm nước. Phối hợp với chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) tạo sản phẩm phổ rộng để phòng trừ sâu hại.
- Đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm ViHa và ViSL có hàm lượng 1,5 x 106 PIB/gam. Phòng trừ sâu hại trên su hào, cải bắp, lạc và thuốc lá tại các vùng ngoại thành Hà Nội, Vĩnh Phúc và Hà Tây (cũ), cho hiệu quả tốt.
Tại Trung tâm bông Nha Hố, cũng trong các năm 2000-2005, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV cũng được tiến hành khá mạnh mẽ theo phương pháp nuôi sâu kết hợp với thu thập nguồn sâu trên đồng ruộng. Sau
đó đem về phòng thí nghiệm lây nhiễm vi rút và nghiền lọc lấy dịch thể chứa vi rút để sử dụng. Trung tâm đã sản xuất được từ 50- 100 lít/năm chế phẩm NPV dạng thô để phòng trừ loại sâu khoang và sâu xanh hại bông.
Việc sản xuất chế phẩm NPV theo phương pháp thu thập sâu non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng. Đem về nhà nghiền lọc, rồi đem nhiễm trên sâu nuôi trong phòng để tạo chế phẩm sử dụng để phòng trừ các sâu này trên đồng ruộng. Cách làm đó đã góp phần khai thác sử dụng nguồn lợi vi rút và các tác nhân gây bệnh cho sâu hại tự nhiên để phòng chống sâu hại cây trồng nông nghiệp.
Tuy nhiên, do thu gom sâu nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng làm thực liệu
để lây nhiễm phát triển chế phẩm nên không thể khẳng định về tác nhân gây bệnh làm chết sâu. Vì vậy, chế phẩm sản xuất ra bao gồm cả vi rút NPV và các tác nhân gây bệnh côn trùng khác, nên chất lượng sản phẩm thường không ổn định. Ngoài ra, việc nhân nuôi sâu non để có số lượng lớn phục vụ
sản xuất chế phẩm gặp rất nhiều khó khăn.
Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc sản xuất chế phẩm NPV đề phòng trừ
sâu đo xanh hại đay và sâu róm hại thông bằng 2 cách: Cách 1 là nuôi sâu non
đến tuổi 3- 4 thì nhiễm NPV và thu hồi sâu chết, nghiền lọc lấy dịch đem sử
dụng hoặc tạo dạng chế phẩm khô; Cách 2: thu sâu non ngoài đồng về nhiễm vi rút, rồi nghiền lọc và đem sử dụng (Nguyễn Văn Cảm và CS. 1996 [2];
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
Trương Thanh Giản và CS. 1996 [3], Hoàng Thị Việt và CS. 2002) [10]. Tuy nhiên, vào các năm sau đó thì cả 2 đơn vị này đều không sản xuất chế phẩm NPV tại chỗ, mà chuyển giao hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân cách thu thập sâu non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng.
Đem về nhà nghiền lọc, rồi đem sử dụng để phòng trừ các sâu này trên ruộng của chính mình. Hoạt động đó đã góp phần nâng cao đáng kể nhận thức và kỹ
thuật cho nông dân trong việc sử dụng nguồn lợi vi rút tự nhiên để phòng chống sâu hại.
Từ kết quả nghiên cứu và sản xuất chế phẩm NPV sâu khoang và sâu xanh của 2 cơ quan nói trên. Nhận thấy để có thể sản xuất chế phẩm qui mô lớn theo phương pháp nuôi sâu cần phải giải quyết một số vấn đề liên quan
đến điều kiện trang thiết bị sản xuất và hệ thống kiểm định chất lượng, cũng như hệ thống đảm bảo vô trùng phòng nuôi nhân sâu nguyên liệu.
Mặt khác, thực tế sản xuất chế phẩm đã gặp phải 2 cản trở lớn nhất về
công nghệ. Trước hết là khả năng nuôi sâu số lượng lớn không thể đạt tỷ suất nhân như mong muốn và không thể chủ động, do tỷ lệ sâu chết bệnh cao và sức sống của sâu qua các đợt nuôi ngày càng kém. Đồng thời, chất lượng thức
ăn sản xuất ra không ổn định, không đáp ứng yêu câu dinh dưỡng cho việc nhân nuôi sâu non.
Những khó khăn phát triển sản xuất chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp như đã nói trên ở Việt Nam cũng hoàn toàn giống như các nước khác trên thế giới. Theo tổng kết của Grzywacz, et al. (1996)[23] thì có 3 vấn đề
cản trở là:
1/ Khả năng sinh sản của sâu giảm nhanh qua thời gian nuôi;
2/ Các dụng cụ, thiết bị nhân nuôi sâu bị nhiễm vi sinh vật hại và vi sinh vật cạnh tranh với NPV làm chất lượng chế phẩm kém;
3/ Không thể cung cấp lượng lớn sâu noncó khối lượng đồng đều, có chất lượng ổn định.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Các tác giả cũng cho rằng có nhiều nguyên nhân không thể sản xuất chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp, song có 6 nguyên nhân quan trọng nhất, đó là:
1/ Chất lượng sâu nuôi kém;
2/ Thực liệu NPV để lây nhiễm không đảm bảo;
3/ Liều lượng NPV lây nhiễm không thích hợp do kích thước sâu không
đều;
4/ Kỹ thuật nuôi sâu rất khó cải tiến;
5/ Thu hồi sản phẩm không đúng lúc do sâu non phát triển không đồng
đều nên mức độ lây nhiễm của vi rút trên sâu không triệt để; 6/ Vệ sinh vô trùng phòng nuôi nhân sâu rất khó khăn.
Song với kết quả nghiên cứu thu được, các nhà nghiên cứu về bảo vệ
thực vật ở Việt Nam cũng đều khẳng định vi rút nhân đa diện (NPV) là tác nhân gây bệnh khá phổ biến và có hiệu quả khá rõ rệt trên các loài sâu hại cây trồng ngoài đồng ruộng (Viện Bảo vệ thực vật, 2006) [13]. Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về vi rút NPV cũng như phát triển thành sản phẩm để
phòng chống sâu hại còn ít và chưa được quan tâm đúng mức.
Nhận xét chung
Qua các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước có được cho thấy: + Ở nước ngoài: Việc nghiên cứu về vi rút côn trùng nói chung và vi rút sâu hại nói riêng được tiến hành từ lâu và trên nhiều khía cạnh, như thành phần, hình thái, sinh học sinh thái và cơ chế xâm nhiễm, gây chết côn trùng của vi rút NPV. Đặc biệt, các nước như Trung Quốc, Ấn độ, Mỹ, Anh, Pháp, v.v. phát triển mạnh việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học vi rút NPV qui mô công nghiệp theo công nghệ nuôi nhân tế bào.
+ Tại Việt Nam: Do điều kiện trang thiết bị chưa có điều kiện đáp ứng cho nghiên cứu chuyên sâu, nhất là trong nghiên cứu về vi rút nói chung và nghiên cứu NPV nói riêng. Đồng thời, việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
NPV trong phòng trừ sâu hại cây trồng mới chỉ tập trung trong nghiên cứu khảo sát, đánh giá tiềm năng của tác nhân vi rút NPV, sản xuất tạo chế phẩm theo hướng thủ công với yêu cầu kỹ thuật công nghệ không quá cao. Tuy nhiên, định hướng nghiên cứu khai thác nguồn vi rút NPV đã được quan tâm nhiều trong những năm gần đây.
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Nguồn thực liệu sâu hại là sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.)
- Nguồn tế bào NPV sâu khoang do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp và được nuôi nhân tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Đấu tranh Sinh học.
- Các loại hóa chất dùng phân lập vi rút: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)(Gibco), Tryphtose broth(Gibco),, Na2CO3, NaOH, nước cất hai lần, sacharose, v.v.
- Các loại môi trường nuôi nhân tế bàovà các môi trường phụ trợ trong nuôi nhân của hãng In-vitrogen (Mỹ) cung cấp. Bao gồm ExcellTM 420 serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), Grace (Gibco), v.v. Huyết thanh Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), photphatse buffer saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), dimethyl sulfoxide 10% (DMSO) (Gibco), trypan blue 0.4%, trypsin-EDTA 10X (Gibco), v.v.. của hãng In-vitrogen (Mỹ) cung cấp.
- Các loại kháng sinh đặc dụng, như: Gentamicine (50mg/ml) (Gibco), Streptomycin (1gram), Penicilin (1.000.000 IU), kháng nấm Fungizone (250µg/ml) (Gibco), dung dịch KCl 0,001%. Các hóa chất có liên quan như: cồn 70%, cồn 98%.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ nuôi sâu: lồng nuôi sâu, chậu nhựa, khay nhựa, đĩa petri, bocan,
ống tuýp, pank, kéo, chổi lông, giấy thấm, bông thấm nước, v.v.
- Các dụng cụ phục vụ cho nuôi cấy, như: pipet man các mức, đầu côn và effendorf các loại, falcon loại 50ml và 15ml, bình nuôi cấy lọc khuẩn loại 25 cm2 và 75 cm2, v.v.
- Các thiết bị phục vụ thí nghiệm: Buồng cấy vô trùng, máy lắc để bàn N- Biotek (Hàn Quốc), máy li tâm 3.000 vòng/phút, tủ nuôi tế bào Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -800C, tủ lạnh thường, micropipette các loại 200µl, 1ml, 2ml, 5ml, kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức), kính hiển vi soi ngược Nikon Ti-U (Nhật Bản), kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu v.v.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành trong 2 năm 2013 và 2014, tại Trung tâm Đấu tranh Sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, phường Đức Thắng, quận Bắc Từ
Liêm, thành phố Hà Nội.
2.3. Nội dung nghiên cứu