Ở Việt Nam, bệnh dịch do virus gây hại cho ong mật kéo dài từ năm này qua năm khác và gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi ong nước ta. Việc nghiên cứu sự phân
52
bố của BQCV qua các năm là vô cùng cần thiết, sẽ giúp chúng ta có chiến lược dự phòng và điều trị bệnh hiệu quả. Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi tiến hành xác định sự phân bố của BQCV trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam. Áp dụng phương pháp RT-PCR với cặp mồi được thiết kế ở trên, chúng tôi đã xác định được sự lây nhiễm và phân bố của BQCV trên các đàn ong mật ở miền Bắc. Kết quả được trình bày ở (phụ lục 2).
Qua bảng số liệu chúng tôi thu được có thể thấy rằng, trên các đàn ong ở hầu hết các địa phương mà chúng tôi khảo sát đều phát hiện thấy sự có mặt của BQCV, trong đó Điện Biên có 4 đàn/18 đàn, Hưng Yên có 3 đàn/18 đàn, Hòa Bình có 0 đàn/18 đàn, Bắc Giang có 5 đàn/18 đàn, Nghệ An có 2 đàn/18 đàn dương tính với virus BQCV. Trong tổng số 90 đàn ong ở miền Bắc mà chúng tôi khảo sát, phát hiện được 14 đàn nhiễm BQCV tương ứng với tỉ lệ 16%. Kết quả này khá thấp so với kết quả nghiên cứu của Trương Anh Tuấn và cộng sự năm 2012, các tác giả cho thấy tỉ lệ nhiễm BQCV ở 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam (Điện Biên, Sơn La, Đắc Lắc, Hưng Yên, Hà Nội) là 51%. Sự suy giảm về tỉ lệ nhiễm virus này có thể là do người nuôi ong đã có những biện pháp tốt hơn trong việc phòng ngừa dịch bệnh, như chọn được mẫu ong chúa khỏe, có chế độ chăm sóc đàn ong tốt hơn và đã kiểm soát được
sự lây nhiễm Nosema apis và Varroa ký sinh - những vật trung gian lây truyền
BQCV dẫn đến giảm tỉ lệ nhiễm BQCV ở các tỉnh miền Bắc. Kết quả khảo sát cũng cho thấy tỉnh Bắc Giang có số trường hợp ong nhiễm BQCV nhiều nhất chiếm 36%, tỉnh Điện Biên có tỷ lệ nhiễm cao thứ hai với số trường hợp nhiễm là 29%, tiếp theo tỉnh Hưng Yên và Nghệ An có số trường hợp nhiễm chiếm lần lượt là 21% và 14%. Ít nhất là tỉnh Hòa Bình không có trường hợp nào bị nhiễm BQCV. Trong tổng số 14 đàn nhiễm BQCV, không phát hiện được BQCV trong các mẫu ấu trùng, tất cả đều phát hiện ở ong trưởng thành. Kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới rằng BQCV gây nhiễm vào ong trưởng thành nhiều hơn ở ấu trùng. Theo báo cáo của Tentcheva và cộng sự (2004), trong một cuộc khảo sát ở một số đàn ong khỏe mạnh tại Pháp thì BQCV được phát hiện trong 86 % mẫu ong trưởng thành và chỉ khoảng 23% mẫu nhộng phát hiện có virus này.
53
Cho đến nay, khoảng 22 loài virus khác nhau được phát hiện gây bệnh trên ong mật. Nhiều loại trong số này có thể gây bệnh tức thì nhưng một số virus khác lại tồn tại trong ong ở dạng tiềm ẩn và có thể nhân lên hàng loạt một cách nhanh chóng khi có điều kiện thuận lợi cho chúng. BQCV là loại virus thuộc nhóm thứ 2, chúng nhiễm vào ong và đợi cơ hội thuận lợi để phát tán trong quần thể ong. Như vậy ở 5 tỉnh miền Bắc khảo sát thì có 4 tỉnh có các đàn ong dương tính với BQCV. Kết quả này cho thấy nguy cơ bùng phát dịch bệnh do BQCV ở các tỉnh miền Bắc là khá cao, do đó cần có những chiến lược kiểm soát dịch bệnh và biện pháp phòng trừ hiệu quả để giảm thiệt hại do BQCV gây ra. Sự phân bố tỉ lệ nhiễm BQCV ở 5 tỉnh miền Bắc được thể hiện trong (hình 3.6).
Hình 3.6. Tỷ lệ nhiễm BQCV giữa các tỉnh miền Bắc Việt Nam 3.3. XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA BQCV LƯU HÀNH TRÊN ONG MẬT TẠI CÁC TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM
Bên cạnh việc phát hiện sự lây nhiễm và sự phân bố của BQCV trên các đàn ong mật ở miền Bắc Việt Nam, việc xác định được nguồn gốc tiến hóa, đặc điểm phân tử của virus này cũng có ý nghĩa hết sức quan trọng, cung cấp các cơ sở khoa học trong công tác dự phòng và khoanh vùng dịch bệnh. Nhằm bước đầu tìm hiểu nguồn gốc tiến hóa của BQCV đại diện lưu hành trên các đàn ong mật ở miền Bắc
Việt Nam, chúng tôi tiến hành phân lập và xác định trình tự gen mã hóa Helicase
54
Thực hiện phản ứng RT-PCR với các mẫu dương tính với BQCV ở trên sử
dụng cặp mồi đặc hiệu gen Helicase chúng tôi đã khuếch đại đoạn gen này từ 6 mẫu
(T272, T285, T287, T309, T320, T329). Các sản phẩm RT-PCR này được tinh sạch và tiến hành giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100. Quá trình
giải trình tự gen mã hóa Helicase được tiến hành như đã mô tả với việc xác định
trình tự đoạn DNA đặc hiệu cho BQCV. Kết quả thu được các đoạn trình tự có chiều dài ~ 650 bp (phụ lục 3 – phụ lục 8).
Khi so sánh các trình tự nucleotide mã hóa Helicase từ BQCV phân lập ở
miền Bắc Việt Nam với nhau chúng tôi nhận thấy chúng có tương đồng rất cao (97 – 100%), trong đó 2 trình tự T278 và T285 có độ tương đồng là 100%. Điều này gợi ý rằng các chủng BQCV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam là cùng một chủng. Tuy
nhiên, khi so sánh các trình tự này với các trình tự gen Helicase công bố trên
Genbank chúng tôi nhận thấy chúng có độ tương đồng thấp, giao động từ 88-93%
với trình tự gen Helicase của BQCV từBalan, Hugary, Áo và Hàn Quốc.
Để tìm hiểu rõ hơn về sự sai khác giữa các chủng BQCV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam với các chủng BQCV trên thế giới, chúng tôi tiến hành xây dựng cây
phát sinh chủng loại dựa trên cơ sở so sánh các trình nucleotide gen Helicase. Cây phát sinh loài được xây dựng bao gồm 6 trình tự gen Helicase từ BQCV ở miền Bắc Việt Nam mà chúng tôi phân lập được và 11 trình tự Helicase từ BQCV ở các quốc
gia khác (Balan, Hungary, Áo và Hàn Quốc) bằng phần mềm MEGA (version 6.1). Thuật toán được chúng tôi sử dụng ở đây là neighbor joining với hệ số boostrap lặp lại 1000 lần. Kết quả được thể hiện ở hình dưới đây:
55
Hình 3.7. Cây phát sinh loài BQCV dựa trên trình tự gen mã hóa Helicase Kết quả cho thấy, cây phát sinh loài chia ra làm 2 nhánh chính. Trong đó các BQCV của Việt Nam và các nước Balan, Hugary, Áo lập thành nhánh thứ nhất còn BQCV từ Hàn Quốc lập thành một nhánh riêng biệt thứ 2. Qua đó thấy rằng BQCV lưu hành ở Việt Nam có thể có nguồn gốc từ các nước châu Âu mà không phải có nguồn gốc từ châu Á (Hàn Quốc). Nguyên nhân của điều này có thể là do người nuôi ong nhập khẩu ong chúa từ các nước châu Âu dẫn đến mang theo mầm bệnh BQCV xâm nhập vào các loài ong bản địa. Tuy nhiên, trong nhánh thứ nhất thì các chủng BQCV của Việt Nam cũng tạo thành một phân nhánh riêng biệt. Điều đó chứng tỏ rằng BQCV tại Việt Nam đã có những biến đổi đáng kể so với các chủng có nguồn gốc từ châu Âu. Một số nghiên cứu cho rằng enzyme này liên quan đến sự khác biệt về độc lực giữa các chủng BQCV khác nhau, do đó có thể thấy độc lực của BQCV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam có mức độ khác biệt so với các chủng BQCV từ châu Á và châu Âu. Mặc dù vậy, cần có thêm những nghiên cứu để làm sáng tỏ giả thuyết này.
EF517510.1- Hungary EF517502 Ao 2 EF517501.1 - Ao EF517512.1 Hungary 2 EF717517 Balan EF517518 Balan2 T272 T309 T320 T285 T329 T287 JQ434127 - Han Quoc JQ434128.1 Han Quoc 2 JQ434129.1 - Han Quoc 3 JQ434130 Han Quoc 4 JQ434131 - Han Quoc 5 79 97 61 100 96 45 38 59 94 60 14 36 30 34 0.2
56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Từ những kết quả thu được trong quá trình điều tra, nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Đã thu thập được 90 đàn ong bao gồm cả mẫu ấu trùng và ong truởng thành từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam: Hưng Yên, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An.
Thiết kế được cặp mồi đặc hiệu BQCV và phát triển được kỹ thuật RT- PCR để phát hiện BQCV gây bệnh trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam. dựa trên trình tự gen mã hóa protein cấu trúc có chiều dài 701bp và trình tự gen mã hóa Helicase có chiều dài 729 bp.
Kết quả khảo sát cho thấy, Bắc Giang là tỉnh phát hiện được số trường hợp ong nhiễm BQCV cao nhất (36%), Điện Biên có tỷ lệ nhiễm BQCV cao thứ hai (29%), tiếp theo tỉnh Hưng Yên và Nghệ An có số trường hợp nhiễm BQCV lần lượt là 21% và 14%. Hòa Bình không phát hiện trường hợp nào bị nhiễm BQCV.
Xây dựng được cây phát sinh loài của BQCV dựa trên 6 trình tự thu được và 11 trình tự BQCV của các quốc gia khác (Balan, Hungary, Áo và Hàn Quốc). Kết quả phân tích cho thấy các chủng BQCV đang lưu hành ở Việt Nam có thể là có nguồn gốc từ các nước châu Âu.
Kiến nghị:
Tiếp tục nghiên cứu phát hiện và khảo sát sự phân bố của BQCV cũng như mở rộng nghiên cứu đối với các virus khác gây bệnh trên ong mật ở các tỉnh khác của Việt Nam để có bức tranh tổng thể sự phân bố của các virus gây bệnh trên ong tại Việt Nam.
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Phùng Hữu Chính (2008), Cẩm nang nuôi ong, Nhà xuất bản Hà Nội. 2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Nguyễn Duy Hoan, Phùng Đức Toàn, Ngô Nhật Thắng (2008), Giáo trình kỹ thuật nuôi ong mật, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
4. Lê Thanh Hoà, Phạm Viết Liên, Phạm Công Hoạt (2004), “Giám định virut gây bệnh
"nhộng bọc" (Sacbrood) ong mật ở Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11(2), tr.19-26.
5. Võ Thị Thương Lan (2011), Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, Nhà
xuất bản giáo dục Việt Nam.
6. Nguyễn Văn Long, Nguyễn Huy Trí, Bùi Thị Điểm, Trần Thị Ngọc (2005), Giáo trình dâu tằm – ong mật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nhà xuất bản Khoa học và
Kỹ thuật.
8. Phạm Hồng Thái, Hà Viết Cường, Nguyễn Văn Giang, Trần Đình Chiến, Nguyễn Văn Đĩnh, Hà Quang Hùng (2011), “Molecular detections of sacbrood and
deformed wing virus infected on Apis mellifera in the northern Vietnam”, Science and technology journal of agriculture and rural development,165, pp. 33 – 36.
9. Trương Văn Tuấn, Đinh Quyết Tâm, Trần Văn Toàn, Lê Quang Trung, Phùng Quốc Chướng, Nguyễn Chi Mai (2012), “Virus trên ong Apis Mellifera và Apis
Cerana ở Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn kỳ 1 tháng 12 năm 2012, tr. 28-33.
10. Phạm Văn Ty (2013), Virut học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
11. Nguyễn Ngọc Vững (2010), “Điều tra, đánh giá thực trạng sản xuất ngành ong
58 Tiếng Anh
12. Alippi, A.M (1999), “Bacterial diseases”, CIHEAM - Options Mediterraneennes, pp. 31-46.
13. Anderson, D. L (1993), “Pathogens and queen bees”, Australasian Beekeeper 94, pp. 292- 296.
14. Anderson D.L, Gibbs A.J (1988), “Inapparent virus infections and their
interactionsin pupae of honey bee (Apis mellifera Linnaeus) in Australia”, J.Gen. Virol, 69, pp. 1617-1625.
15. Allen and Ball (1996), “The incidence and word distribution of honeybee
viruses”, Bee World, 77, pp. 141 – 162.
16. Aubert M., Ball B. V., Fries I., Moritz R., Milani N., Bernardinelli I. (2008),
Virology and the honey bee. Directorate - General for Research EUR, European
Community.
17. Bailey L., Wood LD., (1977), “Two small RNA viruses from honeybees and
further obervations on sacbrood and acture bee paralysis viruses”, J Gen Virol 37,pp. 175 – 182.
18. Bailey L., Ball B.V., Perry J.N, (1981a), “The prevalence of viruses of honey
bees in Britain”, Ann. Appl. Biol, 97, pp. 109-118.
19. Bailey L., Ball B.V., Perry J.N, (1983a), “Association of viruses with two
protozoal pathogens of the honey bee”, Ann. Appl. Biol ,103, pp. 13-20.
20. Bailey L and Ball BV, (1991), “Honeybee pathology”, 2nd end, Academic, London.
21. Ball and Gosh, et al. (1999 ), “The nucleotide sequence of sacbrood virus of the honey bee: an insect picorna-like virus ”, Journal of General Virology, 80, pp.1541
-1549.
22. Byoung-Su Yoon, Lien Thi Kim Nguyen, Thuy Thi Dieu Nguyen, Dong Van Quyen, Suk-Chan Jung, Ki-Yoon Chang, Seung Won Kang (2012) “Phylogenetic
59
analysis of black queen cell virus genotypes in South Korea”, Springer Science+Business Media New York .
23. Bakonyi, T., Farkas, R., Szendroi, A., Dobos-Kovacs, M., Rusvai, M (2002), “Detection of acute bee paralysis virus by RT-PCR in honeybee and Varroa
destructor field samples” rapid screening of representative Hungarian apiaries. Apidologie, 33, pp. 63-74.
24. Chen Y.P Pettis J.S., Collins A., and Feldlaufer M.F. (2006a), “Prevalence and
Transmission of Honeybee Viruses”, Applied and Enviromental microbiology, Vol.
72, No. 1, pp. 606-611.
25. David Stone, M.S. (2005), “An Introduction to Bee Biology”, Prepared for the UIUC BeeSpace Project, pp. 13-14.
26. Elize Lindsay Topley (2009), Molecular detection and characterisation of RNA viruses of honeybees, University of the Western Cape.
27. Ellis, J.D. and Munn, P (2005), “The worldwide health status of honey bees”,
Bee World 86, pp.88-101.
28. FAO, (2006), “Honey bee diseases and pests: a practical guide”, Agricultural and Food Engineering Technical reports, pp. 3 – 8.
29. Glinski, Z., and Buczek, K. (2003), “Response of the Apoidea to fungal
infections”, Apiacta,38, pp.183–189.
30. Grabensteiner E., Bakonyi T., Ritter W., Pechhacker H. and Nowotny N. (2007), “Development of a multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of
three viruses of the honeybee (Apis mellifera L.): Acute bee paralysis virus, Black queen cell virus and Sacbrood virus”, Journal of Invertebrate Pathology, Vol. 94,
No. 3, March 2007, pp. 222-225.
31. Genersch,E., C.Yue, I.Fries, and J.R.Miranda (2006), “Detection of Deformed wing virus (DWV), a honeybee viral pathogen, in bumble bees (Bombus terrestris
60
32. Kondreddy Eswar Reddy, Jin Hyeong Noh, Se Eun Choe, Chang Hee Kweon, Mi Sun Yoo, Huong Thi Thanh Doan, Mummadireddy Ramya, Byoung-Su Yoon, Lien Thi Kim Nguyen, Thuy Thi Dieu Nguyen, Dong Van Quyen, Suk-Chan Jung, Ki-Yoon Chang, Seung Won Kang (2013), “Analysis of the complete genome sequence and capsid region of black queen cell viruses from infected honeybees
(Apis mellifera) in Korea”, Springer Science+Business Media New York.
33. Kilani, M. (1999), “Nosemosis”, CIHEAM - Options Mediterraneennes, pp. 99-
106.
34. Moore, N, F., Reavy, B. & King, L.A. (1985) “General characteristic gene
organization and expression of small RNA viruses of insects”, Journal of Gennal Virology, 66, pp.647459.
35. Mayo, M. A. (2002), “Virus Taxonomy- Houston”, Arch. Virol 147, pp.1071–
1076.
36. Mongi Benjeddou (2002), Molecular detection and genetic manipulation of the
black queen cell virus,University of the Western Cape.
37. Mongi Benjeddou, Neil Leat, Mike Allsopp, and Sean Davision, “Detection of Acute Bee Paralysis Virus and Black Queen Cell Virus from Honeybees by Reverse
Transcriptase PCR” Appl Environ Microbiol. May 2001; 67(5),pp. 2384–2387.
38. M. Higes, F. Esperón and J. M. Sánchez-Vizcaíno (2007), “Short communication. First report of black queen-cell virus detection in honey bees (Apis
mellifera) in Spain”, Spanish Journal of Agricultural Research.
39. Neil Leat, Brenda Ball, Vandana Govan, and Sean Davision, “Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus, a picorna-like virus of honey
bees”, Journal of General Virologyvir.sgmjournals.org, 81, pp.2111–2119.
40. Olivier V., Blanchard P., Chaouch S., Lallemand P., Schurr F., Celle O., Dubios E., Tordo, N., Thiéry, R., Houglgatte, R. & Ribière, M., (2008), “Molecular Characterisation and phylogenetic analysis of chronic bee paralysis virus, a honey
61
41. Rinderer T.E., Rothenbuhler W.C. (1975a) “Responses of three genetically different stocks of the honeybee to a virus from bees with hairless-black syndrome”,
J. Invertebr. Pathol. 25, pp. 297-300.
42. Shimanuki H., and Knox D.A. (2000), “Diagnosis of Honey Bee Diseases, U.S.
Department of Agriculture”, Agriculture Handbook, AH–690.
43. Siede R., Büchler R (2003), “Symptomatic black queen cell virus infection of
drone brood in Hessian apiaries”, Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 116, pp.