Để xác định sự lây nhiệm của BQCV trên ong mật (Apis cerana và Apis mellifera) ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, chúng tôi tiến hành theo sơ đồ nghiên
29
Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các bước thực hiện trong nghiên cứu Thu thập mẫu ong ấu trùng và trưởng thành
Tách chiết RNA tổng số
Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ
Tổng hợp cDNA từRNA tổng số
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu BQCV
Điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%
Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Ecoli
Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR2.1
Tách chiết DNA plasmid
Chọn dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI
Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
Xác định trình tự đoạn DNA đặc hiệu của BQCV
30 2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Ấu trùng ong, ong trưởng thành được thu thập từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc. Mỗi tỉnh thu mẫu ở 6 trại, mỗi trại thu 3 đàn khác nhau, mỗi đàn thu 100 ấu trùng và 100 ong trưởng thành. Hai trại thu mẫu cách nhau ít nhất là 10 km. Mẫu được ký hiệu bằng các chữ cái như ong trưởng thành ký hiệu là T và ấu trùng ký hiệu là A, chữ số kèm theo được đánh theo thứ tự thu thập mẫu như sau: Hưng Yên, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An... Sau đó mẫu được bảo quản trong Ethanol 100% và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Mỗi đàn ong lấy ngẫu nhiên 10 cá thể ấu trùng và 10 cá thể ong trưởng
thành. Tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo các bước sau [44]:
Khử trùng dụng cụ nghiền mẫu
Rửa mẫu ấu trùng và ong trưởng thành bằng DEPC
Nghiền mẫu bằng N2 lỏng, bổ sung thêm nước đã xử lý Rnase
Bổ sung 500µl Trizol, mix đều
Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 2 phút
Loại bỏ cặn, bổ sung Cloroform: isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 với dịch mẫu
Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 30 phút
Hút dịch nổi và bổ sung Isopropanol với tỉ lệ 1:1
Tủa ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 30 phút để thu tủa RNA
Rửa tủa lại bằng 1 ml Ethanol 70%
Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C
Làm khô RNA trong box
Hòa lại cặn RNA trong 30 l nước vô trùng đã loại RNase
Xác định độ tinh sạch và nồng độ RNA trong các mẫu RNA tổng số bằng máy quang phổ nanodrop.
31
2.3.3. Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ nanodrop
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin va pyrimidine. Mức độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260) của mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu. Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các yếu tố như: PH, nhiệt độ, cường độ ion.... Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường axit hoặc kiềm. Trong thí nghiệm RNA được pha loãng trong dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng.
Một đơn vị OD của bước sóng 260nm kí hiệu A260 A260 = 1,0 = 50 µg/ml DNA sợi đôi
A260 = 1,0 = 37 µg/ml DNA sợi đơn A260 = 1,0 = 40 µg/ml RNA
Nồng độ DNA hay RNA được tính theo công thức sau : * Nồng độ DNA sợi đôi : CDNA = OD260 x 50 x d (µg/ml ) CDNA là nồng độ sợi đôi
d là độ pha loãng mẫu
* Nồng độ RNA hay DNA sợi đơn : CDNA/RNA = OD260 x 40 x d CDNA/RNA là nồng độ DNA sợi đơn hay RNA
Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác khi dung dịch acid nucleic sạch. Trong mẫu acid nucleic thường có lẫn các tạp chất. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm. Vì vậy để đánh giá mức độ tinh sạch của dung dịch người ta tính tỉ số OD260/OD280 = T
Nếu T< 1,8 thì chứng tỏ dung dịch acid nucleic có lẫn tạp chất. Nếu 1,8< T < 2,0 thì dung dịch acid nucleic đó được coi là sạch. 2.3.4. Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số
RNA tổng số được dùng làm khuôn để tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng hệ thống enzym phiên mã ngược như khuyến cáo của nhà sản xuất (Invitrogen). Enzym được sử dụng trong phản ứng này là Reverse transcriptase với cặp mồi ngẫu nhiên để tạo cDNA. Các thao tác thực hiện như sau:
32
Bảng 2.1.Thành phần phản ứng của hỗn hợp A
Thành phần Thể tích (µl)
RNA tổng số (30ng–50ng) 7
Mồi ngẫu nhiên (50 ng/µl) 3
Tổng thể tích 10
- Hỗn hợp trên được trộn đều bằng pipet
- Ủ hỗn hợp trên 5 phút ở 65oC bằng máy PCR, sau đó đặt trên đá ít nhất 1 phút +) Chuẩn bị hỗn hợp B với các thành phần phản ứng như (bảng 2.2).
Bảng 2.2.Thành phần phản ứng của hỗn hợp B Thành phần Thể tích (µl) 5X RT Buffer(0,5M Tris-HCl pH-8,3; 0,75M KCl; 0,03M MgCl2) 4 (10 mM) dNTP mix 2 (0,1mM) DTT 2
Inibitor Rnase (20 u/µl) 1
Reverse trancriptase (20 u/µl) 1
Tổng thể tích 10
- Bổ sung 10µl hỗn hợp ở ống B vào ống A để thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA. - Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA tổng số trong máy PCR được thực hiện như (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA
Nhiệt độ (oC) Thời gian
25oC 5 phút
42oC 60 phút
70oC 5 phút
33
2.3.5. Khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho BQCV từ cDNA bằng phản ứng PCR
- Mẫu cDNA được sử dụng làm khuôn tổng hợp đoạn DNA đặc hiệu (701 bp) của BQCV bằng cặp mồi có trình tự như sau [46] :
Trình tự nucleotide Vị trí nucleotide Độ dài sản phẩm khuếch đại BQCV-F 5’- TGG TCA GCT CCC ACT
ACC TTA AAC -3’ 7850–7873
701bp
BQCV-R 5’- GCA ACA AGA AGA AAC
GTA AAC CAC- 3’ 8550–8527
- Sơ đồ chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu của BQCV được thực hiện như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu
Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian
Bước 1 94C 3 phút
Bước 2 94C 40 giây
Bước 3 56C 40 giây
Bước 4 72C 1 phút
Bước 5 Lặp lại 35 chu kì từ
bước 2 đến bước 4 Bước 6 72C 8 phút Bước 7 4o C ∞ 94oC 56oC 72oC 72oC 4oC 35 chu kỳ 3 phút + 40 giây 40 giây 1 phút 8 phút
34 2.3.6. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.Đây là phương phápđược dùng để phân tích, định tính và định lượng trong việc thu nhận mẫu acid nuleic.
Nguyên tắc:
Các phân tử acid nucleic có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Tốc độ di chuyển của phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điên trường.... Điện di trên gel agarose được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định các đoạn DNA. Vị trí của DNA trong gel được xác đinh trực tiếp: Các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethydium bromide và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Các bước thực hiện [44] :
- Chuẩn bị gel agarose nồng độ 1%: Agarose được hòa tan trong đệm TAE 1X. Đun sôi dung dịch đến khi tan hết agarose, sau đó để nguội đến khoảng 50-60oC thì đổ vào khuôn đã lắp lược để tạo các giếng nhỏ. Khoảng 20 phút sau, khi gel đã nguội hoàn toàn thì rút lược ra, đặt bản gel vào bể điện di ở tư thế nằm ngang. Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di dung dịch ngập cách bản gel từ 1-2mm.
- Tra mẫu DNA: Mẫu DNA trước khi tra giếng cần bổ sung thêm dung dịch đệm màu 5X với tỷ lệ 1:5 (chất này là chất vừa có tác dụng tạo mầu để dễ quan sát, vừa giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trước khi điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong gel. Một lượng thang DNA chuẩn cũng được tra vào bản gel để làm chỉ thị phân tử.
35
- Chạy điện di: Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới điện thế ổn định 100V, trong thời gian khoảng 25-30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu loading dye để biết khi nào ngừng điện di (thường thì dừng lại khi loading dye chạy được 2/3 bản gel).
- Nhuộm bản gel bằng dung dịch EtBr: Gel agarose sau đó sẽ được nhuộm với dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong thời gian 15 phút. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ nitơ của acid nucleic và sẽ phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại, giúp cho việc quan sát các vạch DNA. Sau khi nhuộm lấy bản gel tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới tia tử ngoại 254nm của máy soi gel (BioRad). 2.3.7. Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1
Vector pCR2.1 có kích thước 3929 nucleotide, được thiết kế gắn một operon chuyển hóa đường lactose là gen Lac Z. Vùng MCS có chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn.Vector pCR2.1 có chứa gene kháng kháng sinh Ampicillin (bổ sung kháng sinh này trong môi trường nuôi cấy để chọn lọc được khuẩn lạc mang vector pCR2.1. Trong quá trình thiết kế vector pCR2.1 có thò nucleotide T ở 2 đầu, mặt
khác emzyme Taq polymerase thường tổng hợp thừa một nucleotide A phía 3’ của
sản phẩm PCR với hiệu suất lên tới 70%. Điều này làm tăng hiệu quả cho việc liên kết sản phẩm PCR và vector.
Phản ứng gắn được thực hiện với sự xúc tác của enzyme nối ligase. Enzyme này có tác dụng sửa chữa các đột biến liên quan tới mối liên kết phosphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc do hậu quả của việc sao chép DNA. Trong kỹ thuật di truyền được dùng để hàn gắn những chỗ gián đoạn trong chuỗi phosphate. Enzyme ligase nối các nucleotide thông qua 3’- OH và 5’- PO4 liền kề do có một điểm cắt.
Enzyme sử dụng trong phản ứng là T4 - ligase, loại enzyme được dùng phổ
biến và được tách chiết từ vi khuẩn E. coli bị nhiễm phage. Enzyme này có khả năng
nối DNA đầu bằng và đầu dính, hoạt động tốt nhất ở 37oC nhưng thường sử dụng enzyme ở nhiệt độ thấp hơn để ngăn chặn sự biến tính của những đoạn kết cặp ngắn.
36
Hình 2.2. Vector tách dòng pCR2.1
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn nối DNA vào vector tách dòng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O deion 4
Buffer 10X for T4-ligase 1
pCR2.1 (50ng/µl) 1
Sản phẩm PCR (50ng/µl) 3
T4 ligase 1
Tổng thể tích 10
Phản ứng được thực hiện ở 25oC trong 2h.
2.3.8. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli
Biến nạp: Là quá trình đưa DNA tinh sạch vào một tế bào vi khuẩn. Một tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến. Có rất nhiều phương pháp biến nạp như: Hóa biến nạp (đối với vi khuẩn nhờ sốc nhiệt), điện biến nạp (đối với nấm men). … Tính khả biến có thể được cảm ứng trong E. coli nhờ xử lý bằng dung dịch CaCl2. Xử lý này tạo các cổng mở nhất thời trong thành tế bào tạo khả
37 năng cho các DNA di chuyển vào tế bào chủ.
* Tạo tế bào khả biến
- Tế bào E. coli được nuôi qua đêm trong 5ml môi trường LB lỏng.
- Pha loãng huyền dịch tế bào đã nuôi cấy theo tỉ lệ 1:100 trong 5ml môi trường LB. - Nuôi lắc ở 37oC, 200 vòng/phút (v/p), sau 2 giờ kiểm tra mật độ tế bào, giá trị OD600 đạt 0,6 - 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển dịch tế bào sang ống falcon vô trùng, để trên đá trong 30 phút. - Ly tâm thu sinh khối ở 4oC, tốc độ 5.000 v/p trong 10 phút;
- Rửa cặn tế bào bằng 1/2 thể tích CaCl2 100mM ở 4oC. Lặp lại 2 lần.
- Hòa cặn tế bào thành huyền dịch trong 1/20 CaCl2 100mM, chia ra mỗi ống epd 100µl giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi biến nạp, các ống còn lại được giữ trong - 80oC.
* Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào khả biến bằng kỹ thuật sốc nhiệt do Mandel và Hinga phát hiện năm 1970. Các bước tiến hành như sau:
- Bổ sung 10 µl plasmid tái tổ hợp vào ống tế bào khả biến, sau đó cắm trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, sau đó cắm ngay lên đá để 2 phút. - Bổ sung 250 µl môi trường LB lỏng, lắc tốc độ 200v/p, 37oC, trong 1 giờ.
- Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh amp và X- gal, IPTG với nồng độ 100µg/ml.
- Nuôi ở 37oC, qua đêm [44]. 2.3.9. Tách chiết plasmid
Khuẩn lạc sẽ được lựa chọn theo phương pháp khuẩn lạc xanh trắng dựa vào cơ chế hoạt động của operon lacZ. Khuẩn lạc trắng sẽ có khả năng mang gen ngoại
38
lại do đoạn PCR đã chèn vào gen β-galactoside phá vỡ cấu trúc của gen này. Và kết quả không thể thủy phân cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Quy trình tách chiết plasmid được thực hiện như sau [44]:
- Lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi cấy trong lọ penicillin chứa 2ml môi trường LB lỏng có chứa amp (nồng độ 100µg/ml). Nuôi lắc qua đêm ở 37oC, 200v/p. - Lấy 1,5ml dịch nuôi vào ống Eppendorf.
- Ly tâm 12000v/p, trong 1 phút loại dịch, thu tế bào.
- Bổ sung 150µl Sol I (Tris - HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0), trộn đều bằng máy vortex.
- Bổ sung 150µl Sol II (200mM NaOH + SDS 1%), đảo nhẹ.
- Bổ sung 150µl Sol III (Kac - Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ. - Bổ sung 450µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ.
- Ly tâm 12000v/p, 20 phút.
- Hút dịch nổi chuyển sang Eppendorf mới, bổ sung 40µl NaOAc 3M, pH 5,2 và 1000µl ethanol 100%. Để -20oC trong 2 giờ tủa Plasmid.
- Ly tâm 12000v/p, 30 phút, loại dịch nổi thu cặn. - Rửa cặn bằng 500µl ethanol 70%.
- Ly tâm 12000v/p, 15 phút. - Làm khô DNA.
- Hòa cặn DNA trong 40 µl TE - RNAase (100µg/ml). - Ủ ở bể ổn nhiệt 37oC trong 1h loại RNA.
- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.3.10. Cắt kiểm tra plasmid với enzyme giới hạn EcoRI
39
có khả năng nhận biết trình tự nucleotide đặc hiệu trên phân tử DNA khoảng (4 - 8 nu), cắt đặc hiệu phân tử DNA ở những vị trí nhất định tạo thành những đoạn ngắn.
EcoRI là một loại enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA ngay tại vị trí nhận biết
tạo thành các đầu dính.
Trình tự cắt của EcoRI : 5 ‘- G AATTC - 3’ 3' - CTTAA G- 5'
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 5,5
10X Buffer cho E.coRI 1
EcoRI 0,5
Plasmid tái tổ hợp 3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.