Tính đến thời điểm hiện tại, có nhiều phương pháp được dùng để xác định sự có mặt của BQCV ở ong như sử dụng kính hiển vi điện tử, khuếch tán miễn dịch, ELISA và RT-PCR. Trong đó phương pháp RT-PCR được xem là một phương pháp phát hiện trực tiếp, nhanh và nhạy nhất. Chính vì vậy sau khi tách chiết RNA tổng số, chúng tôi tiến hành phân tích sự có có mặt của BQCV trên 180 mẫu ong mật (bao gồm cả mẫu ong trưởng thành và ấu trùng) thu thập từ các trại nuôi ong ở các tỉnh miền Bắc bằng kỹ thuật RT - PCR. Trên cơ sở tham khảo các công trình đã công bố và trình tự hệ gen của BQCV trên Ngân hàng gen quốc tế (Genbank), chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho BQCV.
45
Theo thiết kế, sản phẩm phản ứng RT-PCR thu được có kích thước là 701 bp. Quá trình được thực hiện như mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di phân tích của một số mẫu đại diện được trình bày ở (hình 3.1). Các mẫu cho kết quả dương tính là mẫu xuất hiện băng DNA có kích thước ~700 bp.
Hình 3.1. Kết quả điện di trên gel agarose xác định các mẫu dương tính với BQCV từ các mẫu ong ở miền Bắc Việt Nam.
M : Thang DNA 1kb (Fermantas), 1-8: T265BĐB - T272BĐB, 9-15: T273BHY –T279BHY
Kết quả điện di cho thấy có một số mẫu (giếng 2 và giếng 8 hình 3.1) xuất hiện băng có kích thước ~700 bp, phù hợp với kích thước theo tính toán lý thuyết của đoạn DNA đặc hiệu BQCV là 701 bp. Có thể kết luận các mẫu này dương tính với BQCV. Tuy nhiên, ở tất cả các mẫu đều xuất hiện một băng DNA nhỏ có kích thước khoảng 100 bp không đặc hiệu. Đây có thể là do lượng mồi dư thừa, hoặc là sản phẩm dimer của primer. Để khẳng định chắc chắn sản phẩm RT-PCR với kích thước khoảng 700 bp chính là trình tự DNA đặc hiệu cho BQCV, chúng tôi tiến hành tách dòng gen sản phẩm RT-PCR và giải trình tự DNA để phân tích, so sánh với trình tự DNA của BQCV đã được công bố trên Genbank bằng chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
250b pp 500bp 750bp
46