- Mẫu cDNA được sử dụng làm khuôn tổng hợp đoạn DNA đặc hiệu (701 bp) của BQCV bằng cặp mồi có trình tự như sau [46] :
Trình tự nucleotide Vị trí nucleotide Độ dài sản phẩm khuếch đại BQCV-F 5’- TGG TCA GCT CCC ACT
ACC TTA AAC -3’ 7850–7873
701bp
BQCV-R 5’- GCA ACA AGA AGA AAC
GTA AAC CAC- 3’ 8550–8527
- Sơ đồ chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu của BQCV được thực hiện như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu
Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian
Bước 1 94C 3 phút
Bước 2 94C 40 giây
Bước 3 56C 40 giây
Bước 4 72C 1 phút
Bước 5 Lặp lại 35 chu kì từ
bước 2 đến bước 4 Bước 6 72C 8 phút Bước 7 4o C ∞ 94oC 56oC 72oC 72oC 4oC 35 chu kỳ 3 phút + 40 giây 40 giây 1 phút 8 phút
34 2.3.6. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.Đây là phương phápđược dùng để phân tích, định tính và định lượng trong việc thu nhận mẫu acid nuleic.
Nguyên tắc:
Các phân tử acid nucleic có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Tốc độ di chuyển của phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điên trường.... Điện di trên gel agarose được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định các đoạn DNA. Vị trí của DNA trong gel được xác đinh trực tiếp: Các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethydium bromide và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Các bước thực hiện [44] :
- Chuẩn bị gel agarose nồng độ 1%: Agarose được hòa tan trong đệm TAE 1X. Đun sôi dung dịch đến khi tan hết agarose, sau đó để nguội đến khoảng 50-60oC thì đổ vào khuôn đã lắp lược để tạo các giếng nhỏ. Khoảng 20 phút sau, khi gel đã nguội hoàn toàn thì rút lược ra, đặt bản gel vào bể điện di ở tư thế nằm ngang. Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di dung dịch ngập cách bản gel từ 1-2mm.
- Tra mẫu DNA: Mẫu DNA trước khi tra giếng cần bổ sung thêm dung dịch đệm màu 5X với tỷ lệ 1:5 (chất này là chất vừa có tác dụng tạo mầu để dễ quan sát, vừa giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trước khi điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong gel. Một lượng thang DNA chuẩn cũng được tra vào bản gel để làm chỉ thị phân tử.
35
- Chạy điện di: Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới điện thế ổn định 100V, trong thời gian khoảng 25-30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển của màu loading dye để biết khi nào ngừng điện di (thường thì dừng lại khi loading dye chạy được 2/3 bản gel).
- Nhuộm bản gel bằng dung dịch EtBr: Gel agarose sau đó sẽ được nhuộm với dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong thời gian 15 phút. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ nitơ của acid nucleic và sẽ phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại, giúp cho việc quan sát các vạch DNA. Sau khi nhuộm lấy bản gel tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới tia tử ngoại 254nm của máy soi gel (BioRad). 2.3.7. Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1
Vector pCR2.1 có kích thước 3929 nucleotide, được thiết kế gắn một operon chuyển hóa đường lactose là gen Lac Z. Vùng MCS có chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn.Vector pCR2.1 có chứa gene kháng kháng sinh Ampicillin (bổ sung kháng sinh này trong môi trường nuôi cấy để chọn lọc được khuẩn lạc mang vector pCR2.1. Trong quá trình thiết kế vector pCR2.1 có thò nucleotide T ở 2 đầu, mặt
khác emzyme Taq polymerase thường tổng hợp thừa một nucleotide A phía 3’ của
sản phẩm PCR với hiệu suất lên tới 70%. Điều này làm tăng hiệu quả cho việc liên kết sản phẩm PCR và vector.
Phản ứng gắn được thực hiện với sự xúc tác của enzyme nối ligase. Enzyme này có tác dụng sửa chữa các đột biến liên quan tới mối liên kết phosphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc do hậu quả của việc sao chép DNA. Trong kỹ thuật di truyền được dùng để hàn gắn những chỗ gián đoạn trong chuỗi phosphate. Enzyme ligase nối các nucleotide thông qua 3’- OH và 5’- PO4 liền kề do có một điểm cắt.
Enzyme sử dụng trong phản ứng là T4 - ligase, loại enzyme được dùng phổ
biến và được tách chiết từ vi khuẩn E. coli bị nhiễm phage. Enzyme này có khả năng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nối DNA đầu bằng và đầu dính, hoạt động tốt nhất ở 37oC nhưng thường sử dụng enzyme ở nhiệt độ thấp hơn để ngăn chặn sự biến tính của những đoạn kết cặp ngắn.
36
Hình 2.2. Vector tách dòng pCR2.1
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn nối DNA vào vector tách dòng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O deion 4
Buffer 10X for T4-ligase 1
pCR2.1 (50ng/µl) 1
Sản phẩm PCR (50ng/µl) 3
T4 ligase 1
Tổng thể tích 10
Phản ứng được thực hiện ở 25oC trong 2h.
2.3.8. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli
Biến nạp: Là quá trình đưa DNA tinh sạch vào một tế bào vi khuẩn. Một tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến. Có rất nhiều phương pháp biến nạp như: Hóa biến nạp (đối với vi khuẩn nhờ sốc nhiệt), điện biến nạp (đối với nấm men). … Tính khả biến có thể được cảm ứng trong E. coli nhờ xử lý bằng dung dịch CaCl2. Xử lý này tạo các cổng mở nhất thời trong thành tế bào tạo khả
37 năng cho các DNA di chuyển vào tế bào chủ.
* Tạo tế bào khả biến
- Tế bào E. coli được nuôi qua đêm trong 5ml môi trường LB lỏng.
- Pha loãng huyền dịch tế bào đã nuôi cấy theo tỉ lệ 1:100 trong 5ml môi trường LB. - Nuôi lắc ở 37oC, 200 vòng/phút (v/p), sau 2 giờ kiểm tra mật độ tế bào, giá trị OD600 đạt 0,6 - 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển dịch tế bào sang ống falcon vô trùng, để trên đá trong 30 phút. - Ly tâm thu sinh khối ở 4oC, tốc độ 5.000 v/p trong 10 phút;
- Rửa cặn tế bào bằng 1/2 thể tích CaCl2 100mM ở 4oC. Lặp lại 2 lần.
- Hòa cặn tế bào thành huyền dịch trong 1/20 CaCl2 100mM, chia ra mỗi ống epd 100µl giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi biến nạp, các ống còn lại được giữ trong - 80oC.
* Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào khả biến bằng kỹ thuật sốc nhiệt do Mandel và Hinga phát hiện năm 1970. Các bước tiến hành như sau:
- Bổ sung 10 µl plasmid tái tổ hợp vào ống tế bào khả biến, sau đó cắm trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, sau đó cắm ngay lên đá để 2 phút. - Bổ sung 250 µl môi trường LB lỏng, lắc tốc độ 200v/p, 37oC, trong 1 giờ.
- Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh amp và X- gal, IPTG với nồng độ 100µg/ml.
- Nuôi ở 37oC, qua đêm [44]. 2.3.9. Tách chiết plasmid
Khuẩn lạc sẽ được lựa chọn theo phương pháp khuẩn lạc xanh trắng dựa vào cơ chế hoạt động của operon lacZ. Khuẩn lạc trắng sẽ có khả năng mang gen ngoại
38
lại do đoạn PCR đã chèn vào gen β-galactoside phá vỡ cấu trúc của gen này. Và kết quả không thể thủy phân cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Quy trình tách chiết plasmid được thực hiện như sau [44]: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi cấy trong lọ penicillin chứa 2ml môi trường LB lỏng có chứa amp (nồng độ 100µg/ml). Nuôi lắc qua đêm ở 37oC, 200v/p. - Lấy 1,5ml dịch nuôi vào ống Eppendorf.
- Ly tâm 12000v/p, trong 1 phút loại dịch, thu tế bào.
- Bổ sung 150µl Sol I (Tris - HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0), trộn đều bằng máy vortex.
- Bổ sung 150µl Sol II (200mM NaOH + SDS 1%), đảo nhẹ.
- Bổ sung 150µl Sol III (Kac - Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ. - Bổ sung 450µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ.
- Ly tâm 12000v/p, 20 phút.
- Hút dịch nổi chuyển sang Eppendorf mới, bổ sung 40µl NaOAc 3M, pH 5,2 và 1000µl ethanol 100%. Để -20oC trong 2 giờ tủa Plasmid.
- Ly tâm 12000v/p, 30 phút, loại dịch nổi thu cặn. - Rửa cặn bằng 500µl ethanol 70%.
- Ly tâm 12000v/p, 15 phút. - Làm khô DNA.
- Hòa cặn DNA trong 40 µl TE - RNAase (100µg/ml). - Ủ ở bể ổn nhiệt 37oC trong 1h loại RNA.
- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.3.10. Cắt kiểm tra plasmid với enzyme giới hạn EcoRI
39
có khả năng nhận biết trình tự nucleotide đặc hiệu trên phân tử DNA khoảng (4 - 8 nu), cắt đặc hiệu phân tử DNA ở những vị trí nhất định tạo thành những đoạn ngắn.
EcoRI là một loại enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA ngay tại vị trí nhận biết
tạo thành các đầu dính.
Trình tự cắt của EcoRI : 5 ‘- G AATTC - 3’ 3' - CTTAA G- 5'
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 5,5
10X Buffer cho E.coRI 1
EcoRI 0,5
Plasmid tái tổ hợp 3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.3.11. Tinh sạch plasmid tái tổ hợp
Kít tinh sạch được cung cấp bởi hãng Fermentas
- Bổ sung 100µl Binding Buffer vào 100µl plasmid, trộn đều. - Bổ sung tiếp 100µl isopropanol 100% vào hỗn hợp trên, trộn đều.
- Chuyển 300µl hỗn hợp trên lên cột A/B, ly tâm với tốc độ 10.000 v/p. Loại dịch ở cột B .
- Bổ sung dung dịch Wash buffer 100µl lên cột, ly tâm 10.000v/p. - Đổ hết phần dịch, ly tâm tiếp 12.000v/p. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuyển cột A sang cột B mới.
- Bổ sung 50 µl nước giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút để thu plasmid. - Điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch trên gel agarose 1%.
40
2.3.12. Giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100
Trình tự nucleotide của đoạn DNA đặc hiệu BQCV được xác định theo phương pháp của Sanger trên máy xác định trình tự DNA tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bộ Kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems. Quy trình xác định trình tự được tiến hành theo các bước:
- Thực hiện phản ứng tổng hợp với các thành phần như (bảng 2.7) Bảng 2.7.Thành phần phản ứng giải trình tự gen
H2O vô trùng 5.725 µl
Big dye 3 µl
Dung dịch đệm 3 µl
Mồi (mồi xuôi và mồi ngược) 1.275 µl
Plasmide 2 µl Tổng 15 µl Chu trình nhiệt: Bước 1: 94oC 3 phút Bước 2: 94 oC 40 giây Bước 3: 56 oC 40 giây Bước 4: 72 oC 1 phút 20 giây
Bước 5: Lặp lại 25 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bước 6: 72oC 8 phút
Bước 7: 4 oC ∞
- Sau đó chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự. Quy trình tinh sạch như sau:
Bổ sung 5µl EDTA 125mM pH = 8 vào mỗi ống sản phẩm
Thêm 60µl ethanol 100%
41
Ly tâm 4500 vòng/phút, 45 phút
Thu tủa, rửa cặn bằng 60µl ethanol 70%, hút dịch khoảng 5-7µl
Ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút
Loại dịch, thu cặn
Làm khô DNA bằng máy speedvac
Thêm 15µl hydroformasmide
Biến tính 3 phút ở 95oC
Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100
2.3.13. Nhân dòng gen mã hóa helicase và xây dựng cây phát sinh loài
Để xác định nguồn gốc tiến hóa của BQCV lưu hành tại Việt Nam, chúng tôi
tiến hành xây dựng cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen mã hóa Helicase của
BQCV. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thiết kế mồi: Trên cơ sở trình tự hệ gen BQCV đã công bố trên Ngân hàng gen thế giới và trình tự hệ gen của BQCV gây bệnh trên ong mật Việt Nam, chúng
tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen mã hóa Helicase của BQCV.
Cặp mồi có trình tự như sau:
Trình tự nucleotide Trình tự nucleotide Độ dài sản phẩm khuếch đại BQCV-helF 5’-GGTGTTAGCTATATGCGACACC-3’ 1710-1731 729bp BQCV-helR 5’-TCCTTCCTGGAAGTACATGGC -3’ 2418-2438
Thực hiện phản ứng PCR: Thực hiện phản ứng PCR với các mẫu dương tính với BQCV sử dụng cặp mồi đã thiết kế ở trên.
42
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA mã hóa helicase
Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian
Bước 1 95C 3 phút
Bước 2 95C 30 giây
Bước 3 58C 30 giây
Bước 4 72C 1 phút
Bước 5 Lặp lại 35 chu kì từ bước 2 đến bước 4
Bước 6 72C 7 phút
Bước 7 4C ∞
- Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra tren gel agarose 1%.
- Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100.
Sản phẩm sau phản ứng PCR được tiến hành tinh sạch theo GenJETTMPCR Purification Kit của Fermentas:
Bước 1: Thêm 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều
Bước 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút
Bước 3: Loại dịch phía dưới cột gắn
Bước 4: Thêm 500 µl buffer 2 vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút
Bước 5: Loại dịch phía dưới cột
Bước 6: Lặp lại bước 4 và bước 5
Bước 7: Làm khô bằng cách ly tâm tiếp một lần nữa ở 13000 vòng/phút, trong 1 phút
Bước 8: Thêm 30 µl nước vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút
Bước 9: Chuyển dịch sau ly tâm sang ống eppendoff mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự.
43
Xây dựng cây phát sinh loài: Cây phát sinh loài được xây dựng trên cơ sở
trình tự gen mã hóa Helicase từ BQCV trong nghiên cứu này cùng với các trình tự gen mã hóa Helicase của BQCV đã được công bố trên Ngân hàng gen, bao gồm: 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trình tự từ BQCV gây bệnh trên ong mật ở Balan, 2 trình tự từ Hungary, 2 trình tự từ Áo và 5 trình tự từ Hàn Quốc. Các phần mềm xây dựng cây phát sinh loài mà chúng tôi sử dụng ở đây là Bioedit (version 7.2) và MEGA (version 6.1) với hệ số boostrap lặp lại 1000 lần.
44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÁT HIỆN SỰ LÂY NHIỄM BQCV TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM VIỆT NAM
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Trong nghiên cứu này, các mẫu ong mật thu thập được từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam (Điện Biên, Hưng Yên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An) được kí hiệu từ A255 và T255 theo thứ tự tăng dần đến A344 và T344 (A: là mẫu ấu trùng, T: là mẫu trưởng thành). Mỗi tỉnh gồm 6 trại, mỗi trại gồm 3 đàn bao gồm cả ấu trùng và ong trưởng thành. Như vậy chúng tôi thu được tổng số 90 đàn với 180 mẫu. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, từ mỗi đàn tiến hành chọn ngẫu