3.1.3.1. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Sản phẩm PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV được gắn trực tiếp vào vector tách
dòng pCR2.1 nhờ enzyme T4-ligase, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
DH5α bằng kỹ thuật sốc nhiệt. Quá trình được tiến hành như mô tả ở trên. Sau khi biến nạp, dịch tế bào đem cấy trải lên đĩa petri chứa môi trường LB đặc bổ sung Amp, X- galvà nuôi ở điều kiện 37oC qua đêm. Với môi trường chọn lọc này, chỉ có các tế bào mang vector pCR2.1 có gen kháng kháng sinh Amp mới sống sót và phát triển thành các khuẩn lạc. Chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc, gồm các khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng (kết quả không trình bày ở đây). Các khuẩn lạc mang vector
pCR2.1 gốc (không gắn sản phẩm PCR mà tự đóng vòng) sẽ có màu xanh do gen LacZ
không bị phá vỡ cấu trúc gen nên hoạt động bình thường và tổng hợp được enzyme β- galactosidase. Enzyme này thủy phân cơ chất X- gal thành một sản phẩm có khả năng kết hợp với oxi để tạo thành chất có màu xanh da trời có tên 5,5 dibrom-4,4 dichloro indigo. Trong khi đó các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng do sản
phẩm PCR chèn vào cấu trúc gen LacZ, phá hủy cấu trúc của gen này dẫn đến không
tổng hợp được β-galactosidase.
3.1.3.2. Kết quả tách chiết plasmid
Để chọn lọc vector pCR2.1 mang sản phẩm PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV, chúng tôi nhặt nuôi ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc màu trắng và 1 khuẩn lạc màu xanh làm đối chứng, rồi tiến hành tách chiết plasmid. Quá trình tách chiết plasmid được mô tả ở mục phương pháp nghiên cứu. Plasmid sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện ở (hình 3.2).
47
Hình 3.2. Kết quả tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc màu trắng và khuẩn lạc màu xanh.
Đường chạy 1-4: Plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc màu trắng từ 1-4 Đường chạy ĐC: Plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc màu xanh
Hình ảnh điện di cho thấy plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc màu trắng (đường chạy số 1- 4) đều có kích thước lớn hơn so với plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc xanh (đường chạy DC). Như ta đã biết, trong quá trình điện di, phân tử DNA có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn. Do đó, nhiều khả năng plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng mang đoạn DNA ngoại lai nên kích thước lớn hơn, di chuyển chậm hơn so với plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh (không mang đoạn DNA ngoại lai). Để chắc chắn cho giả
thuyết đó, chúng tôi tiến hành chọn 2 plamid ở trên để cắt kiểm tra với EcoRI. 3.1.3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI
Do vector tách dòng pCR2.1 có hai vị trí cắt của EcoRI ở hai đầu của vùng cắt
gắn đa vị (vị trí gắn của DNA ngoại lai), nên nếu các dòng plasmid có gắn sản
phẩm PCR thì sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI sẽ văng ra một đoạn DNA
có chiều dài tương đương với chiều dài của sản phẩm PCR gắn vào và một băng có
kích thước bằng kích thước của vector PCR2.1. Phản ứng cắt bằng EcoRI được mô
tả như ở trên. Sản phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cắt được thể hiện ở (hình 3.3).
48
Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid
tái tổ hợp bằng EcoRI.
M: Marker DNA 1kb, 1-2: sản phẩm cắt plasmid từ 2 khuẩn lạc màu trắng số 1, 2.
Kết quả phân tích bằng enzyme giới hạn cho thấy, cả 2 dòng plasmid được
chọn sau khi cắt bằng EcoRI đều văng ra đoạn DNA có kích thước bằng với kích
thước đoạn DNA đặc hiệu BQCV theo thiết kế (~700 bp). Từ đó có thể khẳng định chúng tôi đã chọn được 2 dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA đặc hiệu BQCV. Plasmid mang DNA ngoại lai này sẽ được tinh sạch, giải trình tự và so sánh với trình tự DNA của BQCV.