Các phương pháp bố trí thí nghiệm
3.2.9. Nghiên cứu khả năng tái sử dụng protease cố định
Nguyên tắc: Enzyme cố định có ưu điểm nổi trội là khả năng tái sử dụng của chế phẩm. Sau khi cố định enzyme trên nhiều chất mang khác nhau và các phương pháp khác nhau thì sẽ tuyển chọn chế phẩm để thực hiện thí nghiệm tái sử dụng. Tính hữu dụng của enzyme cố định sẽ được kiểm tra [13], [21], [53], [57]:
− Số lần tái sử dụng theo tiêu chí xác định qua HĐcCđ của từng lần một (1) và
HĐc TB50% = dụng sử tái lần n HĐcCđ Tổng (công thức 3) hoặc.
− Sản phẩm tạo ra của chế phẩm enzyme cố định sau mỗi lần sử dụng (2) hoặc
− Thời gian đông tụ sữa sau mỗi lần tái sử dụng (3).
− Thí nghiệm dừng lại theo tiêu chí ‘half-life’: HĐCđ hoặc lượng sản phẩm tạo
ra đã suy giảm tương đương 50% so với HĐCđ hoặc lượng sản phẩm tạo ban đầu.
− Trong luận án sẽ sử dụng phương thức kiểm tra (1) và (2) đối với protease cố
sẽ dựa vào thời gian đông tụ, thời gian đông tụ sữa kéo dài vào khoảng 30 – 40 phút.
Hoá chất và dụng cụ: Chế phẩm enzyme cố định, enzyme hòa tan thương
phẩm, dung dịch albumin 2% w/v, sữa gầy 10% w/v pha trong dung dịch CaCl2
0,01M, thiết bị khuấy trộn, thiết bị ổn nhiệt … Điều kiện thí nghiệm: nhiệt độ là t0
opt, pH = pHopt, tốc độ quay 30 – 45 vòng/phút.
Cách tiến hành: Xác định thời gian tối ưu tạo ra lượng sản phẩm cao nhất dựa trên tiêu chuẩn nitrogen formol tạo ra ‘*’ dựa theo phương pháp của mục 3.2.16.
− Thời gian thực hiện thí nghiệm thủy phân mỗi lần tái sử dụng sẽ tương đương
với nhau như mục ‘*’. Xác định lượng sản phẩm trung bình tạo ra (
n P
Σ ) của
n lần tái sử dụng.
− Xác định lượng enzyme hòa tan (SE) tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm ‘*’
tạo ra lượng sản phẩm tương đương với lượng sản phẩm trung bình của lượng enzyme cố định (IE) tạo thành.
− Xác định tỷ lệ hữu dụng của enzyme cố định (THd) so với enzyme hòa tan
theo công thức sau:
IESE SE (lần)
THd = (công thức 4)
Ghi chú: Xác định lượng enzyme hòa tan tối thiểu để tạo ra sản phẩm tương đương với sản phẩm của chế phẩm enzyme cố định, tính tổng lượng enzyme hòa tan tham gia và so sánh với lượng enzyme cố định trong chế phẩm.
− Riêng trường hợp thí nghiệm đông tụ sữa bán liên tục sẽ dựa vào cơ chế đông
tụ sữa và thời gian trung bình đông tụ sữa các loại formage được trình bày ở mục 2.6 chương 3 ‘Tổng quan tài liệu’ và có thể được quy ra HĐrCđ hoặc HĐcCđ đông tụ sữa. Thời gian đông tụ sữa được chia thành 2 phase ở 2 nhiệt độ khác nhau.
− Phase 1: Nhiệt độ thí nghiệm là 250C với mục đích là hạn chế quá trình đông tụ sữa và thực hiện từng lô theo thời gian là 5, 10, 15 và 20 phút vì ở phase 1 thì protease sẽ tham gia xúc tác phản ứng bằng cách cắt liên kết peptide ở amino acid thứ 105 và 106 của casein theo cơ chế của chymosin. − Phase 2: Nhiệt độ tăng lên 450C với mục đích là tăng nhanh quá trình đông tụ sữa. Phase thứ 2 diễn ra sẽ không có sự tham gia của protease mà là sự tái sắp xếp lại của các casein để tạo ra hiện tượng đông tụ sữa.
− Tuyển chọn tổng thời gian đông tụ sữa: Thời gian phase 1 + phase 2 vào
khoảng 25 – 30 phút dựa theo thời gian đông tụ sữa của fromage Brine Brick.
3.2.10.Nghiên cứu tốc độ dòng chảy của cơ chất ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme cố định
Nguyên tắc: Tốc độ dòng chảy của cơ chất và thể tích cơ chất tham gia trong qua trình xúc tác phản ứng qua cột chứa enzyme cố định sẽ ảnh hưởng tới chất
lượng sản phẩm tạo thành. Các yếu tố cố định bao gồm t0
opt, pHopt, nồng độ của cơ chất và tốc độ dòng chảy với đơn vị là lít/giờ [33], [51], [65]. Để thực hiện thí nghiệm này phải dựa trên các số liệu thu thập của thí nghiệm của mục 3.2.9.
Hoá chất và dụng cụ: Sữa gầy 10% pha trong CaCl2 0,01M. Máy bơm, cột kiểu PBR, thiết bị ổn nhiệt …
Cách tiến hành: Tốc độ dòng cơ chất và sản phẩm ra khỏi cột sẽ có thời gian gần bằng nhau và được tính theo đơn vị ml/phút hoặc l/giờ.
Xác lập chỉ số D theo công thức sau
D (h-1)= (l) (l) (l/h) Rv Fr (công thức 5) Với:
− Fr: Tốc độ dòng chảy bao gồm tốc độ dòng cơ chất và sản phẩm phải bằng nhau (Flow rate) tính theo đơn vị lít/giờ.
− Rv: Thể tích cơ chất tham gia xúc tác phản ứng (Reactor volume) đơn vị tính
là lít.
3.2.11.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản lên hoạt tính enzyme tự do và enzyme cố định tương ứng
Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme sẽ bị suy giảm trong điều kiện bảo quản. Vì vậy cần phải xác định thời gian bán phân rã (half-life) của dung dịch enzyme hòa tan
và enzyme cố định khi bảo quản ở nhiệt độ phòng 29 – 310C và 4 – 70C. Thời
gian kiểm tra hoạt tính protease hoặc đông tụ sữa là tuần/lần [46], [74]. Mục đích là so sánh hoạt độ enzyme hòa tan và cố định theo thời gian bảo quản.