Hiện nay, các nhà khoa học có thể cố định enzyme bằng nhiều phương pháp khác nhau. Dựa theo liên kết giữa chất mang với enzyme, hay enzyme với enzyme mà các nhà khoa học đã chia theo hai nhóm phương pháp chính là những phương pháp vật lý và phương pháp hóa học. Sau đây là một số phương pháp cố định enzyme phổ biến [6], [8], [26].
* Phương pháp đối với enzyme tan (Method for soluble enzymes): Phương pháp được thực hiện khá đơn giản, chúng ta sử dụng màng bán thấm hoặc thiết bị siêu lọc để bao enzyme, màng này cho phép cơ chất đi vào và sản phẩm được tạo thành sẽ thấm ra ngoài môi trường nhưng có một số nhược điểm là sản phẩm tạo thành sẽ thấm ra ngoài môi trường rất khó khăn, khó kiểm soát việc xúc tác phản ứng của enzyme.
* Phương pháp đối với enzyme không tan (Method for insoluble enzymes): Phương pháp này được chia thành hai nhóm phụ.
− Phương pháp liên kết (Bind ; Modified biocatalyst)
− Liên kết chéo (Cross–Linking): Cố định enzyme được thực hiện bởi việc liên kết giữa các phân tử enzyme với nhau hoặc với những nhóm chức năng trong hệ thống matrix chất mang cố định. Sự liên kết này sẽ làm giảm hiệu quả về động học của enzyme, phương pháp này được ứng dụng tốt nhất khi nó kết hợp với một trong những phương pháp khác. Liên kết chéo được thể hiện ở sơ đồ 2.2.
Chất mang Enzyme Nhóm liên kết
Enzyme
Sơ đồ 2.2: Enzyme cố định kiểu liên kết chéo[47]
Hầu hết các chất phản ứng dùng cho quá trình liên kết chéo thường là glutaraldehyde. Phản ứng liên kết chéo được tiến hành dưới những điều kiện khắt khe. Những điều kiện này có thể làm thay đổi cấu hình trung tâm hoạt động của enzyme và vì thế dẫn tới việc giảm đáng kể hoạt lực của enzyme.
− Liên kết với chất mang (Carrier-Binding): Phương pháp này là một kỹ thuật cổ điển trong cố định enzyme. Theo phương pháp này, enzyme liên kết với chất mang và những dẫn xuất của chúng, sau khi cố định enzyme sẽ phụ thuộc vào tính chất của chất mang. Việc chọn lựa chất mang phụ thuộc vào các yếu tố sau: kích thước hạt, diện tích bề mặt, tỷ lệ các phân tử ưa nước với nhóm kỵ nước và thành phần hóa học. Một vài chất mang phổ biến trong việc cố định enzyme thường là dẫn xuất polysaccharide gồm có cellulose, dextran, agarose và gel polyacrylamide. Liên kết chất mang với enzyme được thể hiện ở sơ đồ 2.3.
Sơ đồ 2.3: Enzyme cố định kiểu liên kết với chất mang [47] Phương pháp này được chia ra làm các kiểu phụ:
− Hấp phụ vật lý (Physical adsorption): Phương pháp này dựa trên sự hấp phụ vật lý của enzyme với bề mặt của chất mang không tan trong nước bao gồm lực Van der Waal, liên kết hydrogen … Phương pháp này cũng ít hoặc không làm thay đổi cấu trúc và tâm hoạt động của enzyme cố định. Phương pháp hấp phụ được ứng dụng rộng rãi và đặc biệt là trong giai đoạn đầu nghiên cứu enzyme cố định. Các chất mang có thể sử dụng là silicagel, thủy tinh, hydroxiapatide, polystyrol, cellulose và các dẫn xuất của nó. Nhược điểm của phương pháp này là enzyme cố định dễ dàng hòa tan trở lại khi thay đổi nhiệt độ, pH hoặc lực ion của dung dịch xung quanh. Vì vậy hiện nay ít được sử dụng. − Liên kết ion (Ionic binding): Phương pháp này dựa trên liên kết ion
của enzyme với những chất mang không tan trong nước, các chất mang này có chứa nhóm trao đổi ion. Các polysaccharide và polymer tổng hợp có trung tâm trao đổi ion nên chúng thường được dùng như một chất mang. Liên kết ion giữa enzyme với chất mang thường dễ thực hiện ở những điều kiện bình thường so với liên kết đồng hóa trị. Phương pháp này thì ít làm thay đổi cấu trúc và tâm hoạt động của enzyme. Vì vậy chúng tạo những enzyme cố định có hoạt độ cao trong hầu hết các trường hợp cố định. Theo Mitz và Schuueter thì các enzyme có tính acid như pepsin hay các protease acid thì dễ dàng kết hợp với DEAE–cellulose, còn các enzyme có tính base như trypsin và chymotrypsin lại kết hợp dễ dàng với CM–cellulose, phosphate– cellulose hoặc citrate–cellulose. Các cellulose trao đổi ion này có thể gắn được từ 20 – 50% protein enzyme, nhựa trao đổi ion đã gắn enzyme thì có thể sấy khô ở nhiệt độ thấp. Nhược điểm của liên kết
này là enzyme sẽ bị phóng thích ra khỏi chất mang khi lực ion của cơ chất mạnh hơn hoặc giá trị pH cao hơn giá trị pH của enzyme cố định. − Liên kết đồng hóa trị (Covalent binding): Phương pháp này dựa trên
tính chất bề mặt chất mang có chứa nhóm chức năng sao cho có thể kết hợp với một amino acid thuộc chuỗi bên của enzyme, nằm xa tâm hoạt động, không thay đổi cấu hình của enzyme, không gây trở ngại trong việc tiếp xúc với cơ chất. Những nhóm chức của chất mang có thể liên kết với enzyme bao gồm:
- Nhóm amino - Nhóm carboxyl - Nhóm sulfhydryl - Nhóm hydroxyl - Nhóm imidazole - Nhóm phenolic - Nhóm thiol - Nhóm threonine - Nhóm idole Sau đây là các kiểu liên kết:
− Liên kết diazol: Chất mang —N=N— Enzyme. − Liên kết peptide: Chất mang —CO-NH— Enzyme.
− Liên kết alkyl và aryl: Chất mang —CH2-NH— Enzyme hoặc Chất mang —CH2-S— Enzyme.
− Liên kết dạng base Schiff: Chất mang —CH=N— Enzyme. − Liên kết amid: Chất mang —CNH-NH—Enzyme.
− Liên kết thiol–disulfide: Chất mang —S-S—Enzyme.
Quá trình kết hợp với enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm amin của enzyme. Trong trường hợp ngược lại thì phải qua hai giai đoạn:
− Giai đoạn một là hoạt hóa chất mang. − Giai đoạn hai là kết hợp enzyme.
Các phương pháp hoạt hóa chất mang thường được sử dụng là hoạt hóa bằng cyanogen bromide, phương pháp hoạt hóa azit, phương pháp hoạt hóa bằng phản ứng diazo hoặc hoạt hóa bằng glutaraldehyde …
Một vài kết quả nghiên cứu cố định enzyme trên polysaccharide hoặc dẫn xuất được hoạt hóa bằng muối periodate
− Nghiên cứu của Saiyavit Varavinita và các cộng sự (2002) [79]
Các tác giả ứng dụng phản ứng oxi hóa tạo thành nhóm chức năng aldehyde tại vị trí carbon thứ 2 và 3 của glucose khi cho muối periodate phản ứng với sợi cellulose của bã mía. Cellulose hoạt hóa được sử dụng như chất mang để cố định α-amylase chịu nhiệt của vi khuẩn Bacillus licheneformis. Kết quả thu được là hiệu suất cố định đạt 44% và khả năng
tái sử dụng trên 10 lần.
− Nghiên cứu Canh Le-Tien và các cộng sự (2004) [22].
Các tác giả đã dùng muối periodate hoạt hóa hạt calcium alginate có kích thước 0,1 mm và enzyme được cố định là catalase. Cơ chế hoạt hóa hạt calcium là muối periodate sẽ oxi hóa và bẻ gẫy liên kết carbon ở vị trí 2 và 3 của D-manuronic hoặc L-guluronic và tạo thành nhóm aldehyde. Cấu tạo alginate được trình bày ở phần ‘Khái quát tính chất vật lý và hóa học của alginate’ trang 8. Hiệu suất cố định enzyme đạt từ 95 – 98%.
− Nghiên cứu của Samia A. Ahmed và các cộng sự (2007) [12]
Các tác giả đã sử dụng muối periodate để hoạt hóa amylopectin và cố định protease của vi khuẩn Bacillus licheneformis, Hiệu suất cố định
enzyme là 78,3%. Các tác giả không đề cập khả năng tái sử dụng các chế phẩm mà chỉ so sánh khả năng thủy phân collagen giữa enzyme hòa tan với enzyme cố định.
Các tác giả sử dụng cotton hoạt hóa bởi muối periodate để cố định trypsin. Các tác giả không đề cập tới hiệu suất cố định mà chỉ đề cập khả năng tái sử dụng, hoạt độ chế phẩm giảm khoảng 20% sau 19 lần tái sử dụng. Các tác giả trình bày cơ chế hoạt hóa cellulose cũng tương tự như các tác giả Saiyavit Varavinita và các cộng sự (2002), Canh Le-Tien và các cộng sự (2004).
Cơ chế hoạt hóa chất mang có nguồn gốc là polysaccharide hoặc dẫn xuất được trình bày ở mục 3.2.7 chương 3: Vật liệu và Phương pháp.
− Phương pháp nhốt (Entrapping; Free biocatalyst): Phương pháp này dựa trên sự định vị của các enzyme nằm trong mạng lưới của hệ thống matrix polymer hoặc nằm trong một màng bao bọc. Nhờ vào hệ thống matrix sẽ ngăn cản enzyme lọt ra ngoài nhưng lại cho phép cơ chất xâm nhập vào bên trong. Sự khác nhau giữa phương pháp nhốt với các phương pháp liên kết chéo và liên kết đồng hóa trị ở chỗ bản thân enzyme không liên kết với hệ thống matrix gel hoặc liên kết với màng. Phương pháp nhốt được chia thành ba loại: nhốt enzyme trong khuôn gel (Gel entrapping), nhốt enzyme trong hệ sợi (Friber entrapping) và nhốt enzyme trong vi hạt (Microencapsulation).
Phương pháp nhốt được thể hiện ở sơ đồ 2.4
Sơ đồ 2.4: Enzyme cố định kiểu nhốt [65]