Các phương pháp bố trí thí nghiệm
3.2.6.Cố định enzyme theo phương pháp nhốt (Entrapping method) 1.Cố định enzyme trên chất mang sodium alginate
3.2.6.1. Cố định enzyme trên chất mang sodium alginate
Nguyên tắc: Sodium alginate (tan trong nước) phản ứng với dung dịch calcium chloride sẽ tạo thành calcium alginate không tan trong nước và hình thành hệ thống matrix. Với hệ thống matrix này có thể cố định enzyme hoặc tế bào theo phương pháp nhốt. Ngoài calcium chloride, các muối chloride với các ion dương
đa điện tích như Ba+2, Sr+2... cũng có khả năng phản ứng với sodium alginate và tạo thành barium alginate hoặc strontium alginate không tan trong nước [3], [16], [80]. Trong thí nghiệm, Ca2+ và Ba2+ được ứng dụng trong phương pháp nhốt protease.
Hóa chất và dụng cụ: Dung dịch CaCl2 0,20M, BaCl2 0,15M, các loại protease như mục 3.2.2, dung dịch sodium alginate. Các trang thiết bị hỗ trợ thí nghiệm và thiết bị tạo hạt bằng không khí nén.
Cách tiến hành: 1,5 g sodium alginate + 25 g nước cất, khuấy hỗn hợp tan hoàn
toàn. 100 mgTP protease + 10 g nước cất, khuấy hỗn hợp tan hoàn toàn và thêm
nước thành 50 g. 2 hỗn hợp trên phối trộn và tạo thành dung dịch cố định (DdH) với tổng trọng lượng là 50 g có nồng độ như sau: sodium alginate 3% w/w, protease 2 mgTP/galginate (mgTP: mg thương phẩm protease). Loại bỏ bọt khí trong
DdH trong 5 giờ. Tạo hạt trong 100 ml CaCl2 0,2M hoặc BaCl2 0,2M. Thời gian
tạo hạt cho 100 g DdH vào khoảng 15 phút. Sau khi tạo hạt xong khoảng 45
phút, dùng HCl 1N hoặc NaOH 1N điều chỉnh pH về bằng với pHopt của từng
loại protease, lưu trữ tại nhiệt độ 40C trong khoảng 24 giờ. Rửa hạt bằng dung
dịch HCl có pH = pHopt của từng loại protease, rửa nhiều lần và kiểm tra dung
dịch rửa (DdR) bằng quang phổ kế với λ = 280 nm khi giá trị OD của DdR bằng
giá trị OD của dung dịch HCl. Tại thời điểm này xác định được protein–enzyme không còn thoát ra khỏi hạt. Ngâm hạt trong dung dịch sodium benzoate 0,1%
với pH bằng pHopt của từng loại protease trong 3 giờ. Hạt được sấy quạt gió tại
nhiệt độ 30 – 350C trong 2 – 4 giờ và xác định trọng lượng hạt. Xác định lượng
protein–enzyme trong DdR theo mục 3.2.17. Xác định hoạt độ enzyme cố định theo mục 3.2.13. Xác định hiệu suất cố định theo mục 3.2.8.
Ghi chú : DdR = 200 hoặc 250 ml. Mục đích điều chỉnh này là để thuận lợi trong xác định lượng protein–enzyme không cố định và DdR được điều chỉnh pH = pHopt của từng loại protease.