Nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm thượng hoàng (phellinus linteus)

i HỌ VÀ TÊN TÁC GIẢ LUẬN VĂN: NGUYỄN THỊ HẰNG BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Hằng CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN CHÌM NẤM THƢỢNG HOÀNG (Phellinus linteus) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NĂM TỐT NGHIỆP: 2021 Hà Nội - 2021 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Hằng NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN CHÌMNẤM THƢỢNG HỒNG (Phellinus linteus) Chun ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 842 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Nguyễn Thị Minh Huyền Hà Nội - Năm 2021 iii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn công trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hằng iv Lời cảm ơn Để thực hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ chân thành quý báu thầy cô, anh chị em, bạn bè đồng nghiệp Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Thị Minh Huyền dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới tập thể thực Đề tài: ”Nghiên cứu công nghệ sản xuất sinh khối nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) ứng dụng để sản xuất thực phẩm chức năng”, mã số ĐT.04.18/CNSHCB Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam chủ trì, Bộ Công thương Cơ quan quản lý hỗ trợ kinh phí trang thiết bị cho nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn cán Viện công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ có đóng góp quý báu cho thời gian nghiên cứu Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam truyền đạt kiến thức giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Cuối xin bày tỏ lịng biết ơn đến Gia đình, người thân, bạn bè đồng nghiệp - người động viên, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Mặc dù có nhiều cố gắng, luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến nhà khoa học, quý thầy cô, cán quản lý bạn đồng nghiệp Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Hằng v MỤC LỤC Trang Lời cam đoan iii Lời cảm ơn iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU .1 Lý chọn đề tài: Mục đích nghiên cứu: 3 Nội dung nghiên cứu: Ý nghĩa khoa học tính thực tiễn đề tài: Những đóng góp luận văn: Chƣơng TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ NẤM THƢỢNG HOÀNG 1.1.1.Thành phần hóa học có nấm Thƣợng hồng (Phellinus linteus - PL) 1.1.2 Hoạt tính nấm Thƣợng Hoàng 10 1.2 KHÁI NIỆM VỀ ĐỘNG HỌC CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN 13 1.2.1 Phân loại Gaden 13 1.2.2 Phân loại Deindorfer 14 1.2.3 Phân loại lên men theo sản phẩm 14 1.3 LÊN MEN NẤM THƢỢNG HOÀNG 16 1.3.1 Lên men dịch thể 16 1.3.2 Lên men theo mẻ nấm TH 17 1.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình lên men nấm TH 17 1.4 ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN 18 1.3.1 Khái quát độc tính bán trƣờng diễn 18 1.3.2 Tính bền vững mơi trƣờng độc chất 19 1.3.3 Đặc tính q trình tích lũy sinh học 19 1.3.4 Thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn 21 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 vi 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.2 Máy móc thiết bị 25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Phƣơng pháp nhân giống nấm, cấy chuyển giống nấm lên men 26 2.2.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sinh khối tƣơi 28 2.2.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sinh khối khô 28 2.2.4 Phƣơng pháp xác định đƣờng khử 28 2.2.5 Phƣơng pháp xác định độc tính bán trƣờng diễn 29 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 NHÂN GIỐNG NẤM THƢỢNG HOÀNG VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÊN MEN CHÌM TẠO SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HỒNG 32 3.2 QUY TRÌNH LÊN MEN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HỒNG QUY MƠ 100 LÍT/MẺ 34 3.2.1 Các bƣớc quy trình 34 3.2.2 Kết thực quy trình 40 3.3 ĐỘNG HỌC Q TRÌNH LÊN MEN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HỒNG THEO MẺ CỦA CHỦNG SẢN XUẤT 43 3.3.1 Hàm lƣợng sinh khối tƣơi 43 3.3.2 Kết đo pH 44 3.3.3 Hàm lƣợng sinh khối khô 45 3.3.4 Hàm lƣợng đƣờng khử 46 3.3.5 Động thái sinh trƣởng nấm Thƣợng hoàng 47 3.3.6 Tiểu kết 48 3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA CHẾ PHẨM BỘT SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HỒNG TRÊN THỎ THÍ NGHIỆM 49 3.4.1 Tình trạng thỏ 50 3.4.2 Các số huyết học liên quan tới chức tạo máu, sinh hóa liên quan tới chức gan, thận số glucose huyết tƣơng 51 3.4.3 Quan sát đại thể 55 3.4.4 Quan sát vi thể 55 3.4.5 Tiểu Kết 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng anh Nghĩa tiếng việt g/L Gram / Lít L Lít Dextrose Mơi trƣờng thạch khoai tây để ni cấy vi sinh vật PDA Potato Agar PGA Potato Glucose Agar Môi trƣờng thạch khoai tây để giữ giống Môi trƣờng tối ƣu MTTƢ PL PLP Phellinus linteus Tên khoa học nấm Thƣợng hoàng Polysaccaride đƣợc Phellinus linteus phân lập từ viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Thành phần môi trƣờng lên men lỏng 23 Bảng 2: Thành phần môi trƣờng tối ƣu (MTTƢ) 24 Bảng 3: Thành phần môi trƣờng bổ sung 24 Bảng 4: Kết thu đƣợc lập đƣờng chuẩn với glucose 28 Bảng 5: Các mức liều thử nghiệm bán trƣờng diễn thỏ 30 Bảng 1: Thơng số kỹ thuật q trình lên men quy mô 100l/mẻ 36 Bảng 2: Kết thực quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối nấm Thƣợng hồng (quy mơ bình lên men 100 lít/mẻ) 40 Bảng 3: Chỉ tiêu sau sấy 43 Bảng 4: Kết theo dõi cân nặng thỏ giai đoạn nghiên cứu 50 Bảng 5: Kết xét nghiệm số huyết học trƣớc sau nghiên cứu 51 Bảng 6: Kết xét nghiệm số liên quan đến chức gan trƣớc sau nghiên cứu 52 Bảng 7: Kết xét nghiệm số liên quan đến chức thận trƣớc sau nghiên cứu 54 Bảng 8: Kết xét nghiệm số glucose trƣớc sau nghiên cứu 54 ix DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1: Nấm Phellinus linteus tự nhiên Hình bên trái thể nấm đƣợc thu hoạch, hình bên phải thể nấm mọc gỗ lâu năm Hình Bình sục 5L 27 Hình 2: Đồ thị đƣờng chuẩn glucose phản ứng DNS 29 Hình 1: Hình ảnh nấm đƣợc nuôi cấy đĩa petri môi trƣờng thạch khoai tây………………………………………………………………… 32 Hình 2: Hình ảnh sợi nấm phát triển môi trƣờng lỏng 32 Hình 3: Hình ảnh sợi nấm dƣới kính hiển vi 33 Hình 4: Hình ảnh nấm TH phát triển môi trƣờng thạch môi trƣờng lỏng 33 Hình 5: Sinh khối nấm Thƣợng hồng 34 Hình 6: Sơ đồ quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối nấm TH quy mơ bình lên men 100l/mẻ 39 Hình 7: Đồ thị tƣơng quan hàm lƣợng sinh khối tƣơi sợi nấm theo thời gian sinh trƣởng 44 Hình 8: Đồ thị tƣơng quan độ pH môi trƣờng theo thời gian sinh trƣởng sợi nấm 45 Hình 9: Đồ thị tƣơng quan lƣợng sinh khối nấm theo thời gian sinh trƣởng sợi nấm 46 Hình 10: Đồ thị tƣơng quan hàm lƣợng đƣờng khử môi trƣờng thời gian trình lên men 47 Hình 11: Đồ thị tổng hợp trình sinh trƣởng sợi nấm với yếu tố liên quan đến sinh trƣởng sợi nấm 48 Hình 12: Hình ảnh đại thể quan nội tạng 55 Hình 13: Hình ảnh giải phẫu mơ bệnh học gan 56 Hình 14: Hình ảnh giải phẫu mô bệnh học thận 57 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài: Việt Nam nằm địa hình khí hậu trải dài từ Bắc vào Nam với nhiều điều kiện khí hậu chủ yếu nhiệt đới gió mùa Do nguồn tài nguyên sinh vật phong phú đa dạng Việc sử dụng loại thảo dƣợc phòng điều trị bệnh đƣợc sử dụng từ lâu Trong loại dƣợc liệu, nấm Thƣợng hoàng đƣợc biết tới nhƣ loại thảo dƣợc quý đƣợc vua chúa sử dụng nhƣ thực phẩm bổ sung dinh dƣỡng nhằm nâng cao sức khoẻ, đồng thời sử dụng nhƣ loại dƣợc liệu quý điều trị bệnh Nấm Thƣợng hoàng hay cịn gọi Nấm hồng sơn (sang hwang) có tên khoa học Phellinus linteus, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus Nấm Thƣợng hồng có màu vàng, mọc tự nhiên dâu tằm, sồi, hạt dẻ, keo, thân sồi rộng Đây loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trƣớc Nấm Thƣợng hoàng mọc vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có đến vài chục năm Hiện nay, nguồn nấm Thƣợng hồng có nguồn gốc từ bốn nƣớc Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản Thái lan, nhiên, sản lƣợng nấm khơng cao việc ni trồng tƣơng đối khó Tại Việt Nam, nguồn nấm Thƣợng hoàng đƣợc nhập từ nhiều nƣớc đặc biệt Hàn Quốc với giá bán khoảng triệu đến 10 triệu đồng/kg, cao nấm Linh chi Nấm Thƣợng hoàng loại nấm quý tự nhiên đƣợc ngƣời Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi việc điều trị, tăng cƣờng khả hệ thống miễn dịch, giúp giảm lƣợng cholesterol đƣờng máu Hiện nay, có nhiều nghiên cứu xác định đặc tính quý loại nấm đƣợc áp dụng phòng điều trị bệnh nhƣ tác dụng điều hòa miễn dịch, kháng viêm, kháng ung thƣ kháng oxy hóa Ngồi ra, nấm Thƣợng hồng cịn đƣợc biết có nhiều tác dụng khác nhƣ nâng cao trí nhớ ngƣời già, giảm viêm, giảm đau, giảm căng thẳng, mệt mỏi Trƣớc đây, nhân nuôi sinh khối nấm Thƣợng hoàng nhƣ loại nấm sợi khác đƣợc tiến hành nuôi trồng thân gỗ giá thể, thực chất 52 Sau 28 ngày uống mẫu thử (n=7) Sau 14 ngày dừng uống mẫu thử (n=4) Hemoglobin 12,0 ± 0,8 (g/dL) 12,3 ± 0,5 > 0,05 12,5 ± 0,5 > 0,05 Hồng cầu (x 1012/ L) 5,5 ± 0,4 6,0 ± 0,3 > 0,05 5,9 ± 0,3 > 0,05 Bạch cầu (x 109/ L) 8,4 ± 1,2 7,8 ± 1,1 > 0,05 9,4 ± 2,2 > 0,05 Tiểu cầu (x 109/ L) 507,1 ± 60,3 458,1 ± 64,8 > 0,05 485,4 ± 64,7 > 0,05 Hematocrit (%) 40,2 ± 3,2 42,8 ± 1,8 > 0,05 41,5 ± 1,3 > 0,05 Hemoglobin 12,6 ± 0,9 (g/dL) 13,5 ± 0,6 > 0,05 13,1 ± 0,5 > 0,05 Hồng cầu (x 1012/ L) 6,2 ± 0,3 6,6 ± 0,4 > 0,05 6,3 ± 0,2 > 0,05 Bạch cầu (x 109/ L) 7,9 ± 1,1 9,1 ± 0,5 > 0,05 9,9 ± 1,5 > 0,05 Tiểu cầu (x 109/ L) 435,8 112,1 Hematocrit (%) 44,3 ± 3,7 45,2 ± 3,0 > 0,05 43,8 ± 2,0 > 0,05 Hemoglobin 14,0 ± 0,9 (g/dL) 14,4 ± 0,9 > 0,05 13,6 ± 0,9 > 0,05 ± 401,8 ± 60,5 > 0,05 379,3 ± 64,7 > 0,05 Các số sinh hóa liên quan đến chức gan nhƣ AST, ALT, bilirubin toàn phần, protein toàn phần, cholesterol đƣợc tổng hợp bảng 4: Bảng 6: Kết xét nghiệm số liên quan đến chức gan trƣớc sau nghiên cứu Thời điểm Chỉ tiêu xét nghiệm Nhóm C Nhóm T1 P(T1-C) Nhóm T2 Trƣớc AST (U/ L) 45,1 ± 21,9 65,5 ± 22,0 > 0,05 70,9 ± 32,9 ALT (U/ L) 76,6 ± 28,5 88,1 ± 23,8 > 0,05 93,0 ± 44,9 uống Bilirubin 3,7 ± 1,5 5,5 ± 2,5 > 0,05 3,7 ± 1,9 P(T2-C) > 0,05 > 0,05 > 0,05 53 toàn phần mẫu (μmol/ L) thử (n = 7) Protein toàn phần 54,1 ± 3,7 (g/ L) Cholesterol 2,1 ± 0,7 (mmol/ L) Sau 14 ngày uống mẫu thử (n = 7) Sau 28 ngày uống mẫu thử (n = 7) Sau 14 ngày dừng uống mẫu thử (n = 4) 57,1 ± 4,5 > 0,05 55,0 ± 2,1 > 0,05 2,7 ± 1,5 > 0,05 2,5 ± 0,8 > 0,05 AST (U/ L) 68,6 ± 29,2 57,6 ± 19,4 > 0,05 58,0 ± 19,6 > 0,05 ALT (U/ L) 64,5 ± 11,2 77,1 ± 18,4 > 0,05 71,8 ± 24,8 > 0,05 Bilirubin toàn phần 5,5 ± 1,9 (μmol/ L) 5,5 ± 1,5 > 0,05 7,1 ± 2,6 > 0,05 Protein toàn phần 60,5 ± 2,9 (g/ L) 60,2 ± 1,7 > 0,05 60,4 ± 1,3 > 0,05 Cholesterol 2,0 ± 0,3 (mmol/ L) 1,9 ± 0,5 > 0,05 2,2 ± 0,7 > 0,05 > 0,05 24,3 ± 6,4 > 0,05 AST (U/ L) 43,5 ± 22,3 28,0 ± 4,3 ALT (U/ L) 87,5 ± 31,0 71,1 ± 19,0 > 0,05 67,6 ± 18,9 > 0,05 Bilirubin toàn phần 1,6 ± 0,2 (μmol/ L) 1,4 ± 0,2 > 0,05 1,5 ± 0,2 > 0,05 Protein toàn 62,8 ± 1,7 phần (g/ L) 61,1 ± 1,5 > 0,05 60,8 ± 1,7 > 0,05 Cholesterol 1,8 ± 0,8 (mmol/ L) 1,7 ± 0,8 > 0,05 2,0 ± 0,7 > 0,05 AST (U/ L) 36,7 ± 16,7 39,4 ± 18,2 > 0,05 27,9 ± 5,7 > 0,05 ALT (U/ L) 77,0 ± 22,8 79,1 ± 29,9 > 0,05 74,5 ± 25,6 > 0,05 Bilirubin toàn phần 1,2 ± 0,3 (μmol/ L) 1,4 ± 0,7 > 0,05 1,4 ± 0,4 > 0,05 Protein toàn 61,4 ± 2,8 phần (g/ L) 57,7 ± 2,2 > 0,05 57,6 ± 1,5 > 0,05 54 Cholesterol 2,1 ± 0,8 (mmol/ L) 1,9 ± 0,9 > 0,05 2,5 ± 0,7 > 0,05 Các số Urea Creatinin thƣờng đƣợc xét nghiệm để theo dõi chức thận, đƣợc tổng hợp bảng Urea sản phẩm sau chuyển hóa chất đạm thể Creatinin sản phẩm thối hóa creatin Urea creatinin đƣợc đào thải qua thận Khi nồng độ urea creatinin tăng cao cho thấy rối loạn chức thận thận bị suy giảm khả lọc đào thải hai chất Bảng 7: Kết xét nghiệm số liên quan đến chức thận trƣớc sau nghiên cứu Thời điểm nghiệm xét Chỉ tiêu Nhóm C Nhóm T1 Nhóm T2 5,1 ± 1,2 Trƣớc uống Urea (mmol/L) mẫu thử (n = 7) Creatinin (μmol/ L) 81,2 ± 8,0 4,8 ± 1,0 5,1 ± 1,1 80,1 ± 9,4 84,8 ± 7,2 4,7 ± 0,8 Sau 14 ngày uống Urea (mmol/ L) mẫu thử (n = 7) Creatinin (μmol/ L) 84,2 ± 6,3 4,4 ± 0,5 5,4 ± 0,9 77,9 ± 9,8 89,4 ± 8,6 4,8 ± 0,7 Sau 28 ngày uống Urea (mmol/ L) mẫu thử (n = 7) Creatinin (μmol/ L) 88,7 ± 7,7 4,6 ± 0,6 5,3 ± 0,5 89,1 ± 8,2 95,5 ± 12,7 5,3 ± 0,7 4,8 ± 0,5 5,9 ± 1,2 Sau 14 ngày Urea (mmol/ L) dừng uống mẫu Creatinin (μmol/ L) 99,1 ± 11,2 93,6 ± 20,9 107,9 ± 16,0 thử (n = 4) P(T1-C) > 0,05; P(T2-C) > 0,05 Các số urea creatinin bảng khơng có chênh lệch đáng kể nhóm thử nhóm chứng thời điểm thí nghiệm Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê số so với nhóm chứng (P(T1-C) > 0,05; P(T2-C) > 0,05) Bảng 8: Kết xét nghiệm số glucose trƣớc sau nghiên cứu Thời điểm xét nghiệm Nhóm C Nhóm T1 Nhóm T2 Trƣớc uống mẫu thử (n = 7) 8,2 ± 1,5 7,3 ± 1,1 7,6 ± 1,0 Sau 14 ngày uống mẫu thử (n = 7) 7,8 ± 0,6 7,5 ± 0,6 7,6 ± 0,7 Sau 28 ngày uống mẫu thử (n = 7) 7,8 ± 1,0 7,4 ± 0,5 7,9 ± 0,6 Sau 14 ngày dừng uống mẫu thử(= 4) 8,7 ± 0,8 8,1 ± 0,7 7,9 ± 1,0 P(T1-C) > 0,05; P(T2-C) > 0,05; đơn vị đo: mmol/L 55 Kết xét nghiệm số huyết học (Bảng 3), số sinh hóa liên quan đến chức gan (Bảng 4), chức thận (Bảng 5) số glucose (Bảng 6) cho thấy: Trƣớc sau uống mẫu thử giai đoạn 14 ngày, 28 ngày sau 14 ngày dừng uống: Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê số liên quan đến chức nhóm chứng nhóm thử (PtrướcTN (T-C) > 0,05; Psau 14 ngày(T-C)> 0,05; Psau 28 ngày(T-C)> 0,05), Psau 14 ngày dừng uống mẫu thử(T-C)>0,05) 3.4.3 Quan sát đại thể Kết quan sát đại thể quan nội tạng tất thỏ thử nghiệm cho thấy: khơng có biểu khác thƣờng hình dạng bên ngồi, màu sắc tổ chức tim, gan, thận, phổi, dày, ruột thỏ nhóm thử so với nhóm chứng sau thí nghiệm (Hình 3.18) Nhóm chứng Nhóm thử Nhóm thử ( Liều thấp) (Liều cao) Hình 12: Hình ảnh đại thể quan nội tạng 3.4.4 Quan sát vi thể Tiêu gan, thận đƣợc cố định Formalin 10%, nhuộm dung dịch nhuộm Hematoxylin eosin (HE) Perioric acid Shiff (PAS) quan sát dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần Kết quan sát vi thể Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnh - Trƣờng Đại học Y Hà Nội thực cho thấy: Các thỏ thử nghiệm có gan, thận khơng bị tổn thƣơng, hình ảnh cấu trúc giới hạn bình thƣờng (Hình 3.19 Hình 3.20) Khơng có triệu chứng bất thƣờng liên quan đến mẫu thử với mức liều khác so với nhóm chứng Cụ thể: mơ gan tế bào gan có nhân nhuộm rõ nét màu xanh tím thành phần ngoại bào đƣợc 56 nhuộm màu hồng, cấu trúc đồng đều; mao mạch nan hoa, khoảng cửa, mô kẽ tất bình thƣờng, khơng thấy tổn thƣơng nhóm thử nhóm thử với nhóm chứng (Hình 3.19) Đối với mô thận: Tiểu cầu thận (mao mạch, gian mạch, bao Baoman), ống thận, đài bể thận, mô kẽ tất bình thƣờng, khơng thấy tổn thƣơng (Hình 3.20) Các tế bào thận nhuộm màu đồng đều, nhân tế bào bắt màu xanh tím thành phần ngoại bào bắt màu hồng màu xanh tùy theo thuốc nhuộm Nhóm chứng Nhóm thử Nhóm thử Nhuộm HE (400 x) Nhuộm PAS (400 x) Hình 13: Hình ảnh giải phẫu mơ bệnh học gan Nhƣ mơ gan bình thƣờng, khơng thấy tổn thƣơng nhóm chứng thử 1, thử Các tế bào gan hình đa diện, nhân bắt màu xanh, bào tƣơng bắt màu hồng, tạo thành bè, xen kẽ mao mạch nan hoa, tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy 57 Nhóm chứng Nhóm thử Nhóm thử Nhuộm HE (400 x) PAS (400 x) Hình 14: Hình ảnh giải phẫu mơ bệnh học thận Mơ thận bình thƣờng, khơng thấy tổn thƣơng nhóm chứng nhóm thử 1, thử Tiểu cầu thận không thấy tăng sinh gian mạch, không dính với búi mao mạch, thành khơng dày Ống thận khơng thấy tăng sinh biểu mơ, khơng thấy thối hóa Tế bào ống thận hình trụ vng, nhân bắt màu xanh, bào tƣơng màu hồng Không thấy trụ niệu ống thận Kết quan sát đại thể vi thể cho thấy tất mô tổ chức thể đƣợc quan sát bình thƣờng, khơng có tổn thƣơng tất nhóm thỏ thí nghiệm Nhƣ vậy, sau sử dụng bột sinh khối nấm Thƣợng hồng khơng gây tổn thƣơng quan nội tạng thỏ thí nghiệm tất nhóm thí nghiệm so với nhóm chứng Các nghiên cứu trƣớc polysaccharide nấm Thƣợng hoàng đƣợc sử dụng liều 200mg/kg 30 ngày không làm tăng đáng kể hàm lƣợng ALT AST huyết thanh, LPO gan thận hay khơng thể độc tính [43] Nghiên cứu độc tính cấp dịch triết cồn nấm Thƣợng hoàng tổ hợp với số loại nấm khác liều uống 1000mg/kg/ ngày 14 ngày không biểu dấu hiệu gây chết có độc so với nhóm đối chứng [44] Ngồi có báo cáo đánh giá việc sử dụng dung dịch triết cồn nấm Thƣợng hoàng liều dùng 400mg/kg 23 ngày thể hiệu trống ung thƣ cách đáng kể khơng có tác dụng phụ [45] Hiện với cơng bố giới cịn thiếu nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn nấm Thƣợng hồng [46] Do nghiên cứu 58 đánh giá đƣợc độc tính bán trƣờng diễn bột sinh khối nấm Thƣợng hoàng thỏ nghiên cứu lĩnh vực 3.4.5 Tiểu Kết Mẫu thử bột sinh khối nấm Thƣợng hồng thử độc tính bán trƣờng diễn thỏ có kết nhƣ sau: Sau cho thỏ uống hỗn dịch mẫu thử liên tục 28 ngày với mức liều khác 0,558 g/kg thỏ/ngày (tƣơng ứng với mức liều tối đa dùng cho ngƣời g/ngƣời/ngày) 2,792 g/kg thỏ/ngày (cao gấp lần so với liều dùng tối đa ngoại suy từ liều dùng ngƣời), mẫu thử không ảnh hƣởng đến cân nặng, thể trạng, hoạt động thỏ thử nghiệm Thỏ khỏe mạnh, tăng cân Về số sinh hóa đánh giá chức gan, thận (hoạt độ enzyme AST, ALT máu, albumin huyết tƣơng, cholesterol toàn phần máu, glucose máu, albumin huyết tƣơng, creatinin máu) số huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) khơng có khác biệt có ý nghĩa trƣớc thí nghiệm, sau 14 ngày uống mẫu thử, sau 28 ngày uống mẫu thử, sau 14 ngày dừng uống mẫu thử hai nhóm thử nghiệm so với nhóm chứng (PtrướcTN (T-C) > 0,05, Psau 14 ngày(T-C)> 0,05;Psau 28 ngày(T-C)> 0,05), Psau 14 ngày dừng uống mẫu thử(T-C)>0,05) Không nhận thấy bất thƣờng tổ chức tim, gan, thận, phổi, lách hệ tiêu hóa thỏ thử nghiệm quan sát đại thể nhƣ không nhận thấy tổn thƣơng mô bệnh học gan, thận quan sát vi thể hai nhóm thử nhóm chứng 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * KẾT LUẬN Trong trình nghiên cứu quy trình lên men chìm nấm Thƣợng hồng (Phellinus linteus), thu đƣợc số kết sau: Môi trƣờng nhân giống nấm TH đƣợc tối ƣu gồm nguồn cacbon glucose, nguồn nitơ cao nấm men, thành phần muối khoáng chất vi lƣợng nhƣ kali, magie, mangan, kẽm, sắt đồng Các thơng số kĩ thuật cần thiết quy trình lên men thiết bị 100l/mẻ bao gồm: Môi trƣờng tối ƣu, điều kiện lên men đƣợc điều chỉnh nhiệt độ từ 27oC đến 28oC, tốc độ sục khí lít khí/lít dung dịch/phút, tốc độ khuấy từ 100 đến 150 vòng, tùy theo giai đoạn sợi nấm phát triển độ bền máy Theo dõi động thái sinh trƣởng sợi nấm thiết lập mơ hình cho tăng trƣởng sinh khối sợi nấm theo thời gian 15 ngày, hàm lƣợng đƣờng tổng số 40 g/l, pH: 6,0, tỉ lệ tiếp giống 10%, nhiệt độ lên men 270- 280 Thu mẫu, phân tích lên men 24h/lần với thơng số: hàm lƣợng sinh khối tƣơi khoảng 110 g/l Độ pH giảm dần từ 5,2 xuống 4,2 sau lại tăng dần lúc thu hoạch đạt gần 6.0 Hàm lƣợng sinh khối khô đạt 30 g/l Hàm lƣợng đƣờng khử dịch môi trƣờng nhân nuôi nấm Thƣợng hồng mơi trƣờng lỏng giảm từ 40 g/l xuống khoảng 10 g/l Kết đánh giá độc tính bán trƣờng diễn bột sinh khối nấm Thƣợng hồng thỏ thí nghiệm cho thấy : Sau cho thỏ uống hỗn dịch bột SK nấm TH liên tục 28 ngày với mức liều khác tiếp tục theo dõi 14 ngày sau uống hỗn dịch thử, thỏ khỏe mạnh, hoạt động bình thƣờng, ăn uống bình thƣờng tăng cân, khơng có khác biệt với nhóm chứng Các số sinh hóa đánh giá chức gan, thận khơng có khác biệt có ý nghĩa trƣớc thí nghiệm, sau 14 ngày uống mẫu thử, sau 28 ngày uống mẫu thử, sau 14 ngày dừng uống mẫu thử hai nhóm thử nghiệm so với nhóm chứng Kết tƣơng tự nhận đƣợc số huyết học Khơng có bất thƣờng tổ chức tim, gan, thận, phổi, lách hệ tiêu hóa thỏ thử nghiệm quan sát đại thể nhƣ không thấy tổn thƣơng mô bệnh học gan, thận quan sát vi thể nhóm thí nghiệm 60 * KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu quy trình lên men thiết bị bình lên men lớn nhằm tạo nhiều khả thu hồi đƣợc lƣợng sinh khối nấm để sản xuất sản phẩm nhằm mục đích nâng cao sức khỏe ngƣời 61 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Nguyễn Thị Hằng, Trần Thị Lệ, Nguyễn Thị Liên, Phạm Đức Cƣờng, Nguyễn Thị Minh Huyền, 2020, "Đánh giá độc tính bán trƣờng diễn bột sinh khối nấm Thƣợng Hoàng thu đƣợc từ lên men chìm" Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm tập - số 3, pp 204-213 62 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ying Wang cộng sự, 2007, Structures, biogenesis, and biological activities of pyrano [4, 3-c] isochromen-4-one derivatives from the fungus Phellinus igniarius, Journal of natural products, 70(2), pp 296299 [2] Hye-Jin Hwang cộng sự, 2003, Production and characterization of exopolysaccharides from submerged culture of Phellinus linteus KCTC 6190, Enzyme and Microbial Technology, 33(2-3), pp 309-319 [3] Lee, I K and Yun, B S, 2011, Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp., and their medicinal importance J Antibiot (Tokyo), 64, pp 349-359 [4] Lee, I K and Yun, B S, 2007, Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus, Bioorg Med Chem, 15, pp 3309-3314 [5] http://www.ecofriend.com/mushroom-to-increase-prostate-cancer-drugpower.html) [6] Hye-Jin Hwang cộng sự, 2003, Production and characterization of exopolysaccharides from submerged culture of Phellinus linteus KCTC 6190, Enzyme and Microbial Technology, 33(2-3), pp 309-319 [7] Jo, W S cộng sự, 2006, The Culture Conditions for the Mycelial Growth of Phellinus spp, Mycobiology, 34, 200-205 [8] June Woo Lee cộng sự, 2008, Submerged Culture of Phellinus linteus for Mass Production of Polysaccharides, Mycobiology, 36(3), pp 178-182 [9] Bộ Công Thƣơng, Đại học Công nghiệp Hà Nội, Nghiên cứu công nghệ sản xuất nấm Thƣợng hoàng (Phelinus linteus) dạng hệ sợi, thời gian thực 2015 [10] Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam, Viện Công nghệ Sinh học, Nghiên cứu, sàng lọc chủng nấm Phellinus linteus (nấm Thƣợng Hoàng) tối ƣu điều kiện nuôi cấy lỏng nhằm thu nhận hispidin (hoặc 63 hypholomine B) có khả ức chế Neuraminidase tạo nguyên liệu cho thử nghiệm thuốc chống virus cúm, , thời gian thực 2014 – 2015 [11] Ramberg, J E cộng sự, 2010, Immunomodulatory dietary polysaccharides: a systematic review of the literature, Nutr J, 9, pp 54 [12] Park, I H cộng sự, 2004, A beta-secretase (BACE1) inhibitor hispidin from the mycelial cultures of Phellinus linteus, Planta Med, 70, pp 143-146 [13] Hua Chen cộng sự, 2016, Traditional uses, fermentation, phytochemistry and pharmacology of Phellinus linteus: A review, Fitoterapia, 113, pp 6-26 [14] Jae Hoon Lee cộng sự, 1996, Immunostimulating activity and characterization of polysaccharides from mycelium of Phellinus linteus, Journal of Microbiology and Biotechnology, 6(3), pp 213-218 [15] Lee, Y S cộng sự, 2008, Protein glycation inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus, Biol Pharm Bull, 31, pp 1968-1972 [16] Lee, Y S cộng sự, 2008, Inhibitory constituents of aldose reductase in the fruiting body of Phellinus linteus, Biol Pharm Bull, 31, pp 765-768 [17] Y.C Dai, B.K Cui, 2014, Progress on the species of medicinal fungus Inonotus sanghuang, Journal of Beijing Forestry University ,36, pp 16 [18] R.Q Chen, Y.Q Shi, X.G Lin, X Chen, R.J Jiang, 2005, A preliminary study on the liquid culture conditions of rare medicinal fungus Phellinus linteus, Edible Fungi of China 1, pp 41-44 [19] N.K Zeng, Q.Y Wang, M.S Su, 2008, Submerged culture condition s for production of mycelial biomass and exopolysacchar ides by Phellinus baumii, Chin J Chin Mater Med, 33, pp 1798-1801 [20] X.H Ding, C.P Wen, Z.S Ding, Y.S Fan, 2012, Liquid fermentation of Phellinus igniariusfor production of polysaccharide, Chin Tradit Herb Drugs, 43, pp 906-909 64 [21] C.H Liang, J.L Syu, Y.L Lee, J.L Mau, 2009, Nonvolatile taste components of solid-state fermented adlay and rice by Phellinus linteus, LWT-Food Sci, Technol, 42, pp 1738-1743 [22] X Guo, X Zou, M Sun, 2009, Effects of phytohormones on mycelial growth and exopolysaccharide biosynthesis of medicinal mushroom Pellinus linteus, Bioproc Biosyst Eng, 32, pp 701-707 [23] S.Y Mo, Y.C Yang, J.G Shi, 2003, Studies on chemical constitutes of Phellinus igniarius, Chin J Chin Mater Med, 28, pp 339-341 [24] Ying Wang cộng sự, 2007, Structures, biogenesis, and biological activities of pyrano [4, 3-c] isochromen-4-one derivatives from the fungus Phellinus igniarius, Journal of natural products, 70(2), pp 296299 [25] In-Kyoung Lee cộng sự, 2010, Styrylpyrones from the medicinal fungus Phellinus baumii and their antioxidant properties, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20(18), pp 5459-5461 [26] K.S Song, S.M Cho, J.H Lee, H.M Kim, S.B Han, K.S Ko cộng sự, 1995, B-Lymphocyte-Stimulating polysaccharide from mushroom Phellinus linteus, Chem Pharm Bull, 43, pp 2105–2108 [27] Y.K Kim, H Iwahashi, 2015, Properties of polysaccharides extracted from Phellinus linteus using high hydrostatic pressure processing and hot water treatment, J Food Process Eng, 38, pp 197206 [28] Q Ge, A.Q Zhang, P.L Sun, 2010, Isolation, purification and structural characterization of a novel water-soluble glucan from the fruiting bodies of Phellinus baumii pilat, J Food Biochem, 34, pp 1205-1215 [29] H.K Liu, T.H Tsai, T.T Chang, C.J Chou, L.C Lin, 2009, Lanostane– triterpenoids from the fungus Phellinus gilvus, Phytochemistry, 70, pp 558-563 [30] S.C Huang, P.C Kuo, T.L Hwang, Y.Y Chan, C.H Chen, T.S Wu, 2013, Three novel sesquiterpenes from the mycelium of Phellinus 65 linteus, Tetrahedron Lett, 54, pp 3332-3335 [31] X Wu cộng sự, (2011), Studies on constituents of cultures of fungus Phellinus igniarius, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 36(7), pp 874 - 880 [32] Trần Thị Hiền, Trần Văn Tuấn, Nguyễn Thị Lý, Trần Thị Hoa, Nguyễn Thị Minh Huyền, (2020), Ảnh hƣởng số điều kiện môi trƣờng đến phát triển sinh khối nấm Thƣợng Hoàng (Phellinus linteus), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, (42), tr 20-23 [33] Phạm Quang Thu, 2016, Đặc điểm sinh học nấm thƣợng hồng (Phellinus linteus) ni cấy khiết, Tạp chí Khoa học lâm nghiệp, 1, 4231 - 4237 [34] Trần Thị Lụa, Vũ Văn Hạnh, 2017, Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối nấm Thƣợng hoàng vàng (Phellinus baumi), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 8(81), 106-108 [35] Phƣơng pháp xác định độc tính thuốc, 2014, Nhà xuất học [36] OECD guidelines for testing of chemicals, 2008, Repeated dose 28 days Oral Toxicity study in Rodents, OECD 407 [37] Xue-Mei Tian, Yu-Cheng Dai, Ai-Rong Song, Kun Xu, & Lean-Teik Ng, 2015, Optimization of Liquid Fermentation Medium for Production of Inonotus sanghuang (Higher Basidiomycetes) Mycelia and Evaluation of their Mycochemical Contents and Antioxidant Activities, International Journal of Medicinal Mushrooms, 17(7), pp 681–691 [38] Ali Ghasemzadeh and Neda Ghasemzadeh, 2011, Flavonoids and phenolic acids: Role and biochemical activity in plants and human”, Journal of Medicinal Plants Research, 5(31), pp 6697-6703 [39] Kalyani Pathak and Junmoni Kalita, Flavonoids in Food and Their Benefits in Human Health, Book chapter of Natural Products in Food: Prospects and Applications, pp 246-256 [40] Yi-Li Feng, Wei-Qi Li, Xue-Qian Wu, Jun-Wen Cheng, Su-Yun Ma, 2010, Statistical optimization of media for mycelial growth and exopolysaccharide production by Lentinus edodes and a kinetic model 66 study of two growth morphologies, Biochemical Engineering Journal, 49, pp.104–112 [41] Lefki-Maria Papaspyridi, Nektarios Aligiannis, Evangelos Topakas, Paul Christakopoulos, Alexandros-Leandros Skaltsounis and Nikolas Fokialakis, 2012, Submerged Fermentation of the Edible Mushroom Pleurotus ostreatus in a Batch Stirred Tank Bioreactor as a Promising Alternative for the Effective Production of Bioactive Metabolites, Molecules, 17, pp.2714-2724 [42] J.-L Kim, H.-K Kwon cộng sự, 2000, Studies on cultural characteristics for high density fermentation of Phellinus linteus WI001, Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 28(2), pp 105-110 [43] Shi Zhong, Dong-Feng Ji , You-Gui Li , Tian-Bao Lin , Zhi-Qiang Lv , Hua-Ping Chen, 2013, Activation of P27kip1-cyclin D1/E-CDK2 pathway by polysaccharide from Phellinus linteus leads to S-phase arrest in HT-29 cells, Chemmico-Biological Interaction, 206(2), pp 222-229 [44] H J Park, 2014, CARI III inhibits tumor growth in a melanomabearing mouse model through induction of G0/G1 cell cycle arrest, Molecules, 19(9), pp.14383-14395 [45] Hye-Jin Park, Jeong-Bin Park , Sang-Jae Lee Minjung Song, 2017, Phellinus linteus grown on germinated brown rice increases cetuximab sensitivity of KRAS-mutated colon cancer, International Journal of Molecular Sciences, 18(8), pp.1746 [46] Wenhua Chen, Huiying Tan, Qian Liu, Xiaohua Zheng, Hua Zhang, Yuhong Liu Lingchuan Xu (2019), “A Review: The Bioactivities and Pharmacological Applications of Phellinus linteus”, Molecules, 24(10), pp 1888 ... GIỐNG NẤM THƢỢNG HOÀNG VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÊN MEN CHÌM TẠO SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HỒNG 32 3.2 QUY TRÌNH LÊN MEN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HỒNG QUY MƠ 100 LÍT/MẺ 34 3.2.1 Các bƣớc quy trình. .. men chìm Nội dung nghiên cứu: + Nhân giống nấm Thƣợng hồng nghiên cứu khả lên men chìm giống nấm Thƣợng hồng + Xây dựng quy trình lên men chi tiết cho bƣớc lên men sinh khối nấm Thƣợng hồng từ... cấp quy trình nghiên cứu phải đƣợc chuẩn hóa cho nghiên cứu lên men lƣợng lớn Dựa q trình nghiên cứu nhân giống nấm Thƣợng hồng môi trƣờng thạch lỏng, nhƣ thử nghiệm lên men thiết bị lên men,