3.1. NHÂN GIỐNG NẤM THƢỢNG HOÀNG VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÊN MEN CHÌM TẠO SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG 32 3.2. QUY TRÌNH LÊN MEN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG
3.2.1. Các bước trong quy trình
Bước 1. Giống gốc
Giống gốc là giống nấm dạng sợi, được nhân trên môi trường thạch PGA bằng cách cắt một miếng thạch kích thước khoảng 0,7-1 cm2 đặt lên giữa đĩa thạch mới và ủ trong điều kiện 7-10 ngày ở tủ ấm, nhiệt độ 25-270C, bọc kín. Khi sợi nấm lan gần hết bề mặt đĩa thạch thì giống đƣợc bọc kín và lưu trữ theo các cách lưu trữ giống hoặc được cấy chuyển sang môi trường lỏng để nhân giống cấp I. Giống đƣợc kiểm tra độ tạp nhiễm bằng cách quan
sát bề mặt sợi nấm trên đĩa thạch và dùng móc cấy lấy 1 chút sợi nấm đƣa lên tiêu bản soi dưới kính hiển vi quang học. Giống không tạp nhiễm, phát triển tốt đƣợc sử dụng để nhân giống cấp I.
Bước 2. Giống cấp I
Giống cấp I là giống gốc được nhân trong môi trường lỏng MTTƯ. Giống gốc đƣợc cắt nhỏ thành những mảnh nhỏ sử dụng dao mổ đã khử trùng. Sau đó giống gốc được cấy chuyển vào 50 ml môi trường lỏng MTTƯ trong bình 250 ml. Bình đƣợc lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, nhiệt độ 270- 280C trong vòng 7-10 ngày. Nhiệt độ có thể thay đổi trong tùy thuộc vào mùa trong năm. Mùa hè thường nhiệt độ được đặt là 280C và các mùa khác điều chỉnh là 270C. Điều này giúp giảm áp lực cho máy lắc bởi sự chênh lệch nhiệt độ với môi trường bên ngoài. Đây là bước khởi đầu và chuyển trạng thái của sợi nấm mọc từ môi trường bán rắn (thạch) sang môi trường lỏng. Giống cấp I được kiểm tra khả năng sinh trưởng và độ tạp nhiễm theo cách tương tự như với giống gốc là quan sát bằng mắt thường và dưới kính hiển vi quang học. Khi quan sát bằng mắt thường, ở môi trường lỏng, giống không tạp nhiễm có dung dịch môi trường trong suốt và màu nâu đậm. Giống cấp I không tạp nhiễm, sinh trưởng tốt được cấy chuyển để nhân giống cấp II.
Bước 3. Giống cấp II
Giống cấp I tiếp tục đƣợc cấy chuyển ở tỉ lệ khoảng 10% vào bình tam giác 1 lít trong môi trường MTTƯ, thể tích môi trường cuối cùng có trong bình là 500 ml. Bình tam giác 1 lít này tiếp tục đƣợc lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, nhiệt độ 27oC đến 28oC trong vòng 5-7 ngày. Giống cấp II đƣợc kiểm tra khả năng sinh trưởng và độ tạp nhiễm. Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 5 lít.
Bước 4. Giống cấp III
Giống cấp II tiếp tục đƣợc cấy chuyển ở tỉ lệ khoảng 14% vào bình lên men 5 lít trong môi trường MTTƯ, thể tích môi trường cuối cùng có trong bình là 3500 ml hay 3,5 lít. Hệ thống bình lên men 5 lít đƣợc đặt trong phòng điều hòa ở nhiệt độ 27oC đến 28oC. Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. Thời gian lên men tại bình lên men 5 lít này là 5-7 ngày tùy thuộc vào lƣợng giống và quá trình phát triển của giống. Giống cấp III đƣợc kiểm
tra khả năng sinh trưởng và độ tạp nhiễm. Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 100 lít.
Bước 5. Lên men
Toàn bộ 3,5 lít dịch nhân giống cấp III ở bước 4 phía trên được tiếp sang bình lên men 100 lít chứa 65 lít môi trường MTTƯ có bổ sung Penicillin/Streptomycin ở nồng độ 1 (IU/ml) /2 (àg/ml) và chất phỏ bọt (50 ppm) đƣợc cấp khi quan sát thấy bọt xuất hiện. Điều kiện lên men đƣợc điều chỉnh ở nhiệt độ từ 27oC đến 28oC. Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. Tốc độ khuấy từ 100 đến 150 vòng, tùy theo giai đoạn của sợi nấm phát triển và độ bền của máy. Thông thường, trong vòng 2 ngày đầu, tốc độ khuấy có thể để ở 100 vòng/phút. Từ ngày thứ 3 trở lên, tốc độ khuấy điều chỉnh lên xuống liên tục từ 100 vòng/phút đến 150 vòng/phút nhằm đảm bảo sinh khối phát triển tốt, không vón cục và bảo toàn trục khuấy của máy. Quá trình lên men tại thiết bị này đƣợc duy trì trong vòng 12-15 ngày nhằm mục đích giúp sợi nấm có thể tích lũy các hoạt chất sinh học quý của chúng.
Bước 6. Thu sinh khối
Sử dụng máy vắt ly tâm để thu sinh khối. Một ống dây đường kính khoảng 2cm đƣợc nối với đầu ra của bình lên men. Khi mở đầu này thì sinh khối từ bình lên men trực tiếp chảy vào trong máy vắt ly tâm. Cho máy chạy ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 20 phút để thu sinh khối. Mỗi mẻ có thể tích 10 lít môi trường. Dịch lên men chảy ra ngoài trong khi sinh khối được giữ lại trong máy vắt ly tâm. Kết thúc mỗi mẻ, sinh khối đƣợc lấy ra và cất vào tủ lạnh để chờ các bước tiếp theo.
Các thông số sau khi hiệu chỉnh các bước của quy trình trên được tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 3. 1: Thông số kỹ thuật trong quá trình lên men quy mô 100 lít/mẻ
TT Các bước trong
quy trình
Thông số
1 Bước 1: Giống gốc - Môi trường thạch PGA.
- Kích thước khoảng 0,7- 1 cm2.
- Ủ trong điều kiện 7-10 ngày ở tủ ấm.
- Nhiệt độ 25-27oC, bọc kín.
- Giống không tạp nhiễm, phát triển tốt đƣợc
sử dụng để nhân giống cấp I.
2 Bước 2: Giống cấp I - Môi trường lỏng MTTƯ.
- Thể tích 50 ml môi trường lỏng MTTƯ trong bình 250 ml.
- Tốc độ lắc 150 vòng/phút.
- Nhiệt độ 27oC.
- Thời gian 7 - 10 ngày.
- Giống cấp I không tạp nhiễm, sinh trưởng tốt đƣợc cấy chuyển để nhân giống cấp II.
3 Bước 3: Giống cấp II - Môi trường MTTƯ.
- Tỉ lệ cấy chuyển khoảng 10%.
- Thể tích môi trường là 500 ml vào bình tam giác 1 lít.
- Tốc độ lắc 150 vòng/phút.
- Nhiệt độ 27oC đến 28oC.
- Thời gian 5 - 7 ngày.
- Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 5 lít.
4 Bước 4: Giống cấp III - Môi trường MTTƯ.
- Tỉ lệ cấy chuyển khoảng 14%.
- Thể tích môi trường 3,5 lít trong bình lên men 5 lít.
- Nhiệt độ 27oC đến 28oC.
- Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút.
- Thời gian 5-7 ngày.
- Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 100 lít.
5 Bước 5: Lên men - Môi trường MTTƯ.
- Tỉ lệ cấy chuyển khoảng 5,4%.
- Thể tích môi trường 65 lít trong bình lên men
100 lít - Penicillin/Streptomycin nồng độ 1 (IU/ml) /2 (àg/ml) - Chất phỏ bọt (50 ppm).
- Nhiệt độ từ 27oC đến 28oC.
- Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút.
- Tốc độ khuấy từ 100 đến 200 vòng, tùy theo giai đoạn của sợi nấm phát triển .
- Thời gian trong vòng 5-7 ngày.
- Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 500 lít.
- Hoặc thu sinh khối để dùng cho các mục đích khác trong khoảng 12 – 15 ngày.
6 Bước 6. Sinh khối - Máy vắt ly tâm để thu sinh khối.
- Tốc độ 3000 vòng/phút trong 20 phút.
- Thể tích 10 lít môi trường/mẻ.
- Lưu mẫu ở tủ lạnh.
Quy trình nhân giống và lên men đƣợc tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 3. 6: Sơ đồ quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối nấm
Thƣợng hoàng trên quy mô bình lên men 100 lít/mẻ
Sinh khối
Giống cấp I
(Bình 250ml, 50ml MTTƢ 150 vòng/phút, 7-10 ngày, 27o-28oC)
Giống gốc
(Nấm dạng sợi, trên thạch PGA)
Cấy chuyển, rắn – lỏng
Giống cấp II
(Bình 1 lít, 500ml MTTƢ,150 vòng/phút, 5-7 ngày, 27o-28oC) Cấy chuyển, lỏng - lỏng
Giống cấp III
(Bình 5 lít, 3,5 lít MMTƢ, sục khí 1lít/lít/phút, 5-7 ngày, 27o-28oC)
Cấy chuyển, lỏng – lỏng
Lên men
(Thiết bị lên men 100 lít, 65 lít MTTƢ, sục khí 1lít/lít/phút,
Khuấy 100-150 vòng, 12-15 ngày, 27o-28oC)
Vắt li tâm ( 3000 vòng/phút, 20 phút/mẻ
(
Dịch nuôi
Cấy chuyển, lỏng – lỏng